Desarrollan nueva herramienta para el diagnóstico de la infección crónica por el VHB

Sin embargo, los métodos utilizados para realizar estos análisis tienen la limitación de la poca sensibilidad o la incapacidad para detectar más de una mutación a la vez. Otros métodos son demasiado engorrosos o caros para uso clínico.

Los investigadores de la Universidad Médica de Fujian (República Popular de China) mejoraron esta situación al establecer una coamplificación altamente sensible para una PCR de temperatura de desnaturalización más baja (COLD-PCR), acoplada con el análisis de la curva de fusión con fluorescencia basada en la sonda (FMCA) para el diagnóstico preciso de los pacientes con ICHB.

COLD-PCR (coamplificación a una temperatura de desnaturalización más baja-PCR) es un protocolo modificado de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) que enriquece los alelos variantes de una mezcla de ADN con mutaciones y de tipo salvaje. La capacidad de amplificar e identificar preferentemente los alelos minoritarios y las mutaciones somáticas de ADN de bajo nivel en presencia de alelos de tipo salvaje en exceso es útil para la detección de mutaciones.

El análisis de la curva de fusión es una evaluación de las características de disociación del ADN bicatenario durante el calentamiento. A medida que se eleva la temperatura, la doble cadena se comienza a disociar, lo que conduce a un aumento de la intensidad de la absorbancia, la hipercromacidad. La temperatura a la que se desnaturaliza el 50% del ADN se conoce como temperatura de fusión. La información recopilada se puede usar para inferir la presencia e identidad de las mutaciones de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP).

Se demostró que el método COLD-PCR/FMCA era capaz de detectar el ADN del VHB, los genotipos y las mutaciones RT, simultáneamente. Se evaluó sistemáticamente el desempeño analítico de este método, incluida la imprecisión, la exactitud, la sensibilidad, los límites de detección, el intervalo lineal y su capacidad para detectar variantes menores.

Los resultados revelaron que el método COLD-PCR/FMCA podía detectar mutaciones del VHB a concentraciones mucho más bajas que otras técnicas como la secuenciación PCR/FMCA o la secuenciación PCR Sanger (1% frente a 10% frente a 20%, respectivamente). La nueva técnica también podía diferenciar las distintas fases de la infección por el VHB de acuerdo con la proporción y el tipo de mutaciones, así como mediante la detección del ADN del VHB.

“Las guías han confirmado que la monitorización dinámica del ADN del VHB, los genotipos y el ADN mutante de la transcriptasa inversa (RT), es de gran importancia para evaluar el estado de la infección, predecir la progresión de la enfermedad y juzgar la eficacia del tratamiento en pacientes infectados con el VHB”, dijo el autor principal, el Dr. Qishui Ou, investigador en medicina de laboratorio en el primer hospital afiliado de la Universidad de Medicina de Fujian. “Creemos que COLD-PCR/FMCA proporciona una poderosa herramienta de laboratorio para el diagnóstico y tratamiento precisos de los pacientes infectados con el VHB”.

“Nuestro objetivo era establecer un método más práctico y económico y con alta sensibilidad para detectar el genotipo y las mutaciones RT y al mismo tiempo detectar el ADN del VHB”, dijo el Dr. Ou. “Hasta ahora no había enfoques de alto rendimiento para detectar el ADN del VHB, el genotipo y las mutaciones RT simultáneamente. Por lo tanto, es necesario establecer un método más práctico y económico con alta sensibilidad para detectar el genotipo y las mutaciones RT mientras se detecta el ADN del VHB. COLD-PCR/FMCA tiene ese potencial”.

El estudio se publicó en la edición en línea del 10 de octubre de 2019 de la revista Journal of Molecular Diagnostics.

Enlace relacionado:
Universidad Médica de Fujian