Nuevo análisis de PCR detecta reordenamientos genéticos en muestras de cáncer de pulmón

Esta proteína comprende un dominio extracelular, un tramo hidrofóbico que corresponde a una sola región transmembrana de paso, y un dominio de quinasa intracelular. Desempeña un papel importante en el desarrollo del cerebro y ejerce sus efectos sobre las neuronas específicas en el sistema nervioso. Se ha encontrado que este gen está reordenado, mutado, o amplificado en una serie de tumores, incluyendo los linfomas anaplásicos de células grandes, el neuroblastoma y el cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC).

El gen de fusión de EML4-ALK es responsable por aproximadamente el 3%-5% de los casos de NSCLC. La prueba estándar que se utiliza para detectar este gen en muestras de tumores es la hibridación fluorescente in situ (FISH), pero también se pueden usar otras técnicas tales como la inmunohistoquímica (IHC) y la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) para detectar el cáncer de pulmón con un gen de fusión ALK.

Los tejidos incluidos en parafina y fijados con formol (FFPE) son los ejemplares más ampliamente disponibles para los estudios clínicos retrospectivos de mecanismos de las enfermedades. Estos materiales archivados proporcionan una valiosa fuente de ácidos nucleicos estables para el análisis de expresión de genes, utilizando la reacción de cadena de la polimerasa, reversa, cuantitativa, en tiempo real (qRT-PCR) o el análisis mediante microarrays. A medida que el uso de la tecnología PCR se ha vuelto más prevalente en las pruebas moleculares, ha mejorado la utilidad clínica de los tejidos FFPE. Sin embargo, la recuperación de ARN de calidad, a partir de muestras FFPE, es a menudo problemático, dado que el proceso de fijación provoca reticulación entre los ácidos nucleicos y las proteínas, y modifica covalentemente el ARN mediante la adición de grupos monometil a las bases. Como resultado, las moléculas son rígidas y susceptibles a la cizalladura mecánica y formación de enlaces cruzados puede comprometer el uso de ARN como sustrato para la transcripción inversa. Por lo tanto, a fin de utilizar tejidos FFPE como fuente para el análisis de la expresión génica, se requiere un método fiable para la extracción de ARN a partir de la matriz reticulada.

Los investigadores en el Instituto de Farmacología, Dra. Margarete Fischer-Bosch Clínica (Stuttgart, Alemania) describieron recientemente el desarrollo de un nuevo ensayo basado en el ARN para detectar reordenamientos de ALK en los NSCLC. Esta técnica se basa en la PCR cuantitativa, en tiempo real ((q) RT-PCR), e incluyó dos características novedosas: un método de aislamiento de ARN que fue optimizado para revertir la modificación por el formaldehído y pequeños amplicones de RT-PCR para permitir el uso de ácidos nucleicos fragmentados para la amplificación eficiente de los ADNc de ALK. La prueba mide la expresión de las porciones 5' y 3' de la transcripción de ALK, por separado.

El análisis de una serie de muestras de FFPE de pacientes con NSCLC reveló que el ensayo detectó la expresión desequilibrada de ALK indicativa de un reordenamiento del gen, en 24 (4,6%) de 523 especímenes interpretables de NSCLC y la expresión del transcrito de ALK, de longitud completa en seis tumores (1,1%). Se realizó tanto el análisis FISH como qRT-PCR en 182 tumores; la qRT-PCR tipificó con exactitud el 97% de 19 tumores con reordenamientos de ALK y 158 sin reordenamientos.

“La técnica de qRT-PCR detecta de forma fiable los tumores con reordenamientos de ALK independientemente de la pareja de fusión y también identifica los tumores con la expresión de longitud completa de la expresión del gen que no es detectable por FISH, pero que también puede ser relevante para la terapia de inhibidores de ALK”, dijo la autora principal, la Dra. Claudia Kalla, una investigadora postdoctoral en el Instituto de Farmacología Clínica, Dra. Margarete Fischer-Bosch. “La técnica parece ser un método sensible, fácil de realizar, y de alto desempeño, adecuada para el diagnóstico de rutina de activación de ALK no sólo en el cáncer de pulmón, sino también en otras entidades tumorales donde están prevalentes los reordenamientos con parejas de fusión alternativas o la regulación positiva de la transcripción”.

El estudio fue publicado en la edición de marzo 2014 de la revista Journal of Thoracic Oncology.

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Dr. Margarete Fischer-Bosch Institute of Clinical Pharmacology