Usan método de amplificación isotérmica para detectar subtipos de Salmonella

Más del 85% de los brotes de salmonelosis humana en Australia fueron causados por cinco serovares de Salmonella. La identificación rápida, exacta y sensible de los serotipos de Salmonella es vital para el diagnóstico y la vigilancia de la salud pública.

Los métodos tradicionales basados en cultivos para la detección de patógenos de Salmonella son lentos, laboriosos y costosos. Se han sugerido técnicas basadas en PCR (PCR y PCR en tiempo real) y técnicas de amplificación isotérmica, como la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP), como alternativas. La amplificación de desplazamiento cruzado múltiple (MCDA) emplea 10 cebadores, en lugar de los seis usados en la LAMP o los dos que se usan en la PCR, para reconocer 10 regiones distintas, que mejoran su especificidad y sensibilidad.

Los biotecnólogos de la Universidad de Nueva Gales del Sur (Sídney, Australia) desarrollaron y evaluaron siete ensayos de MCDA para la detección rápida y la diferenciación de los cinco serovares de Salmonella más comunes en Australia: Typhimurium, Enteritidis, Virchow, Saintpaul e Infantis. Los conjuntos de cebadores para la MCDA se diseñaron dirigidos a siete marcadores genéticos específicos de los serovares/linajes, que fueron identificados mediante comparaciones genómicas. El equipo utilizó un total de 111 cepas.

Para evaluar los siete conjuntos de cebadores MCDA, se usó el ensayo invA MCDA con el gen específico de la especie de Salmonella como control positivo. Las reacciones MCDA se realizaron en una máquina de PCR en tiempo real, Corbett Rotor-Gene 6000 (Corbett Life Science, Sídney Australia) con el kit de amplificación de ADN, WarmStart LAMP (Nueva Inglaterra BioLabs, Melbourne, Australia) en un volumen total de 10 μL de mezcla de reacción incubada a 63°C durante 60 minutos y luego calentada a 95°C durante cinco minutos para detener la amplificación. Se usó la medición de colorante fluorescente LAMP en tiempo real para controlar la amplificación de MCDA cada minuto.

Los investigadores informaron que la sensibilidad y especificidad de los siete ensayos de MCDA se evaluaron utilizando 79 cepas objetivo y 32 cepas no objetivo. Todos los ensayos fueron altamente sensibles y específicos para los serovares objetivo, con una sensibilidad que oscilaba entre el 92,9% y el 100% y la especificidad entre el 93,3% y el 100%. El límite de detección de los siete ensayos de MCDA fue de 50 fg por reacción (10 copias) de ADN puro, y se detectaron resultados positivos en tan solo ocho minutos. Estos siete ensayos MCDA ofrecen un método de serotipificación rápido, exacto y sensible. Con una validación adicional en condiciones clínicamente relevantes, estos ensayos se podrían usar para la serotipificación independiente de cultivos de serovares comunes de Salmonella directamente de muestras clínicas.

Ruiting Lan, PhD, profesor y autor principal del estudio, dijo: “Reducir las infecciones de los fenotipos principales que causan la mayoría de los brotes, ayudará desde el nivel cero hasta el nivel clínico para reducir las infecciones por Salmonella”. El estudio fue publicado en la edición de mayo de 2020 de la revista The Journal of Molecular Diagnostics.

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Universidad de Nueva Gales del Sur
Corbett Life Science
New England BioLabs