La tecnología CRISPR de nanogotas permite una identificación micobacteriana rápida y multiplexada

Las infecciones micobacterianas son difíciles de diagnosticar porque las especies estrechamente relacionadas pueden tener distintas implicaciones clínicas y terapéuticas. Las micobacterias no tuberculosas (MNT) se reconocen cada vez más como causas importantes de enfermedad pulmonar, mientras que las infecciones mixtas y la variación a nivel de cepa pueden complicar las pruebas estándar.

Los métodos actuales, incluidos el cultivo, la espectrometría de masas y los ensayos moleculares, siguen siendo importantes, pero pueden tener limitaciones en la identificación multiplex de especies. Un nuevo comentario destaca un enfoque basado en CRISPR diseñado para combinar una detección amplia con un análisis a nivel de especie.

Investigadores de la Facultad de Medicina de la Universidad Jiao Tong de Shanghái analizan la plataforma denominada CANDI (Plataforma de emparejamiento de nanogotas asistida por CRISPR para la identificación diferencial de MNT) en LabMed Discovery. El comentario examina una plataforma desarrollada originalmente por el grupo de investigación y publicada en Science Translational Medicine. CANDI integra amplificación de amplio rango, reconocimiento específico de especie mediante CRISPR, codificación por fluorescencia y emparejamiento de gotas microfluídicas dentro de una sola arquitectura diagnóstica.

La plataforma utiliza una estrategia de diseño basada en el genoma. Su desarrollo incluyó el análisis de 103.332 genomas de Mycobacterium para identificar regiones conservadas en los genes 16S y 23S del ARN ribosómico (ARNr) para la amplificación de amplio rango. Luego se seleccionaron ARN guía específicos de especie con base en las diferencias de secuencia entre especies, teniendo también en cuenta la conservación de secuencia dentro de las especies diana.

Este diseño está destinado a respaldar una amplia cobertura de dianas, al tiempo que preserva la especificidad a nivel de especie. También pretende reducir los falsos negativos relacionados con la variación de secuencia a nivel de cepa. Al separar la amplificación, el reconocimiento molecular, la identidad de la señal y la organización espacial, CANDI ofrece un marco para la detección molecular multiplex escalable sin depender de diseños de cebadores multiplex cada vez más complejos.

El comentario también destaca la capacidad de CANDI para analizar muestras mixtas. La plataforma puede identificar simultáneamente múltiples especies micobacterianas y demostró resolver mezclas que contenían hasta cinco especies, incluidos organismos estrechamente relacionados. En la evaluación clínica, detectó algunos organismos que no se recuperaron mediante cultivo, lo que los autores sugieren que puede reflejar sensibilidad analítica molecular directa o organismos de baja abundancia que son difíciles de cultivar.

Se necesita más trabajo antes de que CANDI pueda utilizarse de forma rutinaria en los laboratorios clínicos. Los principales desafíos incluyen abordar la variación genómica, interpretar en contexto clínico las detecciones independientes del cultivo de baja abundancia y automatizar la generación de gotas, el emparejamiento, la obtención de imágenes y el análisis computacional. Los autores identifican como importante el desarrollo de un flujo de trabajo estandarizado de muestra a respuesta para trasladar este tipo de tecnología molecular multiplex a la práctica clínica.

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Shanghai Jiao Tong University School of Medicine

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