Novedoso análisis de subtipificación detecta genes de virulencia del Clostridium

Los métodos actuales para el diagnóstico de C. difficile incluyen el cultivo de heces, las pruebas para toxinas, inmunoanálisis enzimáticos y reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Sin embargo, estos métodos no son prácticos en la mayoría de los entornos clínicos, debido a que requieren de dos a tres días para dar resultados, durante el cual los médicos deben confiar en el tratamiento empírico de la enfermedad con antibióticos.

Científicos de la Universidad de Brown (Providence, Rhode Island, EUA) han desarrollado un nuevo ensayo de PCR, junto con una plataforma de pequeño volumen, en tiempo real, que permite la detección rápida y sencilla de tres genes de la toxina de C. difficile: La toxina B de Clostridium difficile (tcdB), y la tcdC y las toxinas de unión de distensión citoletales (cdtB). La amplificación de ADN de los genes tcdB, tcdC y cdtB se realizó usando una plataforma de sándwich basado en gotitas con PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) en gotas de microlitros para detectar e identificar los fragmentos amplificados de ADN. El tamaño del producto se determinó a través chips Agilent ADN 1000 en un sistema Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA).

Los investigadores identificaron la presencia de C. difficile en muestras clínicas de heces a través de una serie de tres pasos: aislamiento de ADN de doble cadena, la amplificación de segmentos de ADN específicos a los genes de C. difficile de interés en que pueden producir proteínas que confieren híper-virulencia, y la detección de los productos de PCR mediante el uso de qPCR o la electroforesis capilar. Se diseñaron tres conjuntos de cebadores de PCR para amplificar tres regiones específicas de ADN, cada uno situado dentro de un gen con un papel potencial en la codificación para la producción de proteínas implicadas en la gravedad de la enfermedad asociada con la infección por C. difficile.

El equipo llegó a la conclusión de que su técnica de amplificación de genes múltiplex proporciona un método único que es a la vez sensible y específico para detectar rápidamente C. difficile en muestras de heces de pacientes. Este método se puede adaptar a las pruebas de punto de atención y por lo tanto puede ayudar a los médicos en el desarrollo y la aplicación de mejores regímenes de tratamiento para el cuidado de los pacientes con infecciones por C. difficile, particularmente aquellos con la cepa NAP1/027/BI. El estudio fue publicado el 13 de enero de 2014, en la revista Journal of Molecular Diagnostics.

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Brown University

Agilent Technologies