Extraen ADN viral de muestras de histología

El ADN de los tejidos en parafina (FFPE) puede ser usado para la genotipificación del virus del papiloma humano, pero existen problemas potenciales.

Estos problemas para la genotipificación del virus del papiloma humano (VPH), incluyen la parafina como una barrera física, el entrecruzamiento del ADN y los inhibidores de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Los investigadores de los Centros para el Control y Prevención de Enfermedades de los EUA (CDC, Atlanta, GA, EUA) extrajeron el ADN de cortes de 10 micras de 150 muestras de cáncer en FFPE. Combinaron un kit de aislamiento de ADN disponible en el mercado, el kit de tejido y sangre DNeasy, con un tratamiento térmico y evaluaron el ADN resultante con respecto a la tipificación del VPH. La parafina fue eliminada usando xileno y el tejido se lisó a 56°C. Un segundo corte fue incubado directamente a 120°C y posteriormente lisado a 65°C. Después de la purificación en columna-spin, ambos extractos fueron analizados con un ensayo de determinación del genotipo de array lineal del VPH. El rendimiento de ADN celular, las copias de ADN de VPH16 y los inhibidores de la PCR fueron evaluados cuantitativamente usando análisis de PCR en tiempo real (qPCR).

Los resultados inadecuados de los ensayos de genotipificación con array lineal VPH fueron significativamente más frecuentes en los extractos tratados con xileno que en los extractos sometidos a tratamiento térmico. La detección del VPH también difirió, con 94/150 (62,7%) positivos en los tratados con xileno y 110/150 (73,3%) resultados positivos en los extractos de tratamiento térmico. El método del calor también produjo 8,2 veces más ADN celular amplificable para PCR y 6.5 veces más copias de VPH16, aunque los inhibidores de la PCR también tuvieron un efecto mayor.

El kit de sangre y tejido DNeasy usado en el estudio es un producto de Qiagen (Valencia, California, EUA, www.qiagen.com) y algunas mejoras pueden ser debidas al aumento de calor durante el tratamiento con proteinasa K en el kit, que anteriormente se había encontrado que era más eficaz para la lisis del tejido. La mejora también podría ser debida a la reversión del entrecruzamiento, debido al formaldehído, de los ácidos nucleicos durante la incubación a 120°C. Todos los ensayos de qPCR fueron realizados en un termociclador C1000 con un sistema en tiempo real CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). Los autores concluyeron que el tratamiento térmico agresivo demostró una ventaja sobre los protocolos tradicionales de purificación de xileno, obteniendo rendimientos más altos de ADN y una mayor sensibilidad para la prueba de VPH. El estudio fue publicado el 4 de julio de 2011, en la revista The Journal of Molecular Diagnostics.

Enlaces relacionados:

US Centers for Disease Control and Prevention

Qiagen

Bio-Rad