PCR digital en gotitas permite cuantificación de biomarcadores de microARN

La tecnología de reacción en cadena de la polimerasa digital en gotitas (ddPCR) puede ser usada para cuantificar de manera precisa y reproducible los microácidos ribonucleicos (miARN), en plasma y suero, en diferentes días.

Los miARN son abundantes en muchos tipos celulares, existen en formas extracelulares, altamente estables y pueden suministrar información directa sobre los procesos de las enfermedades y son estudiados activamente como marcadores biológicos en sangre, para el cáncer y otras enfermedades.

Los científicos del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson (Seattle, WA, EUA) compararon la ddPCR con la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR) que se ha utilizado para la medición analítica de los miARNs en muestras de sangre. Sin embargo, los científicos han encontrado que las mediciones mediante qPCR de los miARNs en suero o plasma muestran una variabilidad interdiaria inaceptablemente alta, lo que socava el uso de miARNs, en sangre, como biomarcadores fiables.

La PCR digital tiene muchas ventajas sobre la qPCR incluyendo la capacidad de proporcionar una cuantificación absoluta sin una curva estándar y robustez a las variaciones en la eficiencia de la PCR para diferentes muestras y análisis. Estas y otras ventajas se materializan en el sistema QX100 Droplet Digital PCR (ddPCR) (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA).

El equipo realizó análisis anidados de ddPCR frente qPCR en el ADN complementario (ADNc) a partir de una serie de diluciones de seis miARNs sintéticos diferentes, tanto en agua como en plasma en tres días diferentes. En comparación con la qPCR, los investigadores encontraron que la ddPCR demostró una mayor precisión con respecto a la variación específica en la PCR. Se recogieron muestras de suero de 20 pacientes con cáncer de próstata avanzado y 20 controles masculinos emparejados por edad y midieron la abundancia del miARN, miR-141, que se ha demostrado es un biomarcador para el cáncer de próstata avanzado.

Las muestras se analizaron por qPCR y ddPCR con series de dilución individuales, preparados en tres días diferentes. Ellos encontraron que la ddPCR mejoró la reproducibilidad del día a día en siete veces, en relación con la qPCR. También fue capaz de demostrar las diferencias entre las muestras de casos en comparación con las muestras de control con mucha mayor confianza que la qPCR.

Muneesh Tewari, MD, PhD, autor principal del estudio, dijo: La PCR digital en gotita nos permitirá seguir con exactitud las concentraciones de biomarcadores de microARN en suero con el tiempo durante los tratamientos de los pacientes, algo que ha sido casi imposible de lograr con la PCR en tiempo real. Hemos elegido utilizar el sistema de PCR digital en gota QX100de Bio-Rad, ya que fue el primer sistema en el mercado que podría hacer la PCR de manera práctica desde un punto de vista del costo y el desempeño para el uso rutinario en el laboratorio”. El estudio fue publicado el 1 de septiembre 2013, en la revista Nature Methods.

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Fred Hutchinson Cancer Research Center

Bio-Rad Laboratories