Caracterización molecular de la microbiota en el líquido cefalorraquídeo usando WGA

La hidrocefalia es una causa común de discapacidad neurológica en los niños. La colocación de una derivación de líquido cefalorraquídeo (LCR) permite que los niños con hidrocefalia sobrevivan y eviten una lesión cerebral continua.

Comprender la etiología de las infecciones y reinfecciones de la derivación del líquido cefalorraquídeo requiere una caracterización detallada de los microorganismos asociados. Tradicionalmente, la identificación de bacterias presentes en el LCR se ha basado en métodos de cultivo, pero estudios recientes han utilizado secuenciación de alto rendimiento de genes de ARNr 16S.

Los neurocirujanos del Hospital Infantil de Seattle (Seattle, WA, EUA) y sus colegas inscribieron en un estudio a un subconjunto de niños con fracasos en el tratamiento de la infección de la derivación de LCR (es decir, tuvieron una reinfección de la derivación de LCR) y se les extrajo líquido cefalorraquídeo tanto al principio como al final de ambos episodios de infección. Todas las muestras se analizaron mediante cultivo aeróbico de LCR de rutina en los laboratorios certificados de los hospitales.

El ADN se extrajo y se purificó de las muestras de LCR utilizando el kit de aislamiento de ADN AGOWA mag Mini (AGOWA, LGC Genomics, Berlín, Alemania) y la construcción de la biblioteca de amplicones de microbiota de LCR se llevó a cabo mediante una amplificación por PCR de un solo paso dirigida a la región V4 del gen 16S de ARNr bacteriano. La secuenciación de las bibliotecas agrupadas se llevó a cabo durante 600 ciclos en un secuenciador de escritorio Illumina MiSeq utilizando el kit de reactivos MiSeq v3 (Illumina, San Diego, EUA). La amplificación del genoma completo (WGA) de ADN purificado a partir de muestras de LCR y dos muestras comunitarias simuladas se llevó a cabo utilizando el Mini Kit REPLI-g (Qiagen, Hilden, Alemania) y se secuenció en la plataforma Illumina HiSeq 2500 para producir 96 pb apareadas al final.

Las asignaciones taxonómicas de secuencias de WGA y 16S se compararon entre sí y con cultivos microbiológicos convencionales. Si bien la clasificación de las bacterias fue consistente entre todos los enfoques, WGA proporcionó información adicional sobre la composición microbiológica de la muestra, como mostrar abundancias relativas de ADN microbiano frente a humano, identificar muestras de calidad cuestionable y detectar una carga viral significativa en algunas muestras. Una muestra arrojó suficientes lecturas no humanas para permitir el ensamblaje de un genoma de Staphylococcus epidermidis de alta calidad, denominado CLIMB1, que fue caracterizado en términos de su perfil de tipificación de secuencias multilocus (MLST), complemento de genes (incluidos genes de resistencia a los antimicrobianos putativos) y similitud a otros genomas de S. epidermidis anotados.

Los autores concluyeron que habían demostrado que la WGA aplicada directamente al LCR es una herramienta valiosa para la identificación y caracterización genómica de los microorganismos dominantes en las infecciones de la derivación del LCR, lo que puede facilitar los enfoques moleculares para el desarrollo de mejores métodos de diagnóstico y tratamiento. El estudio fue publicado el 20 de agosto de 2021 en la revista Frontiers in Cellular and Infection Microbiology.

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Hospital Infantil de Seattle
LGC Genomics
Qiagen