Sistema de microarrays basados en CRISPR permite pruebas masivas para patógenos virales

Un novedoso sistema de diagnóstico microfluídico basado en ácidos nucleicos es capaz de detectar un virus específico de un catálogo de más de 160 patógenos humanos, incluido el coronavirus COVID-19, simultáneamente en más de mil muestras.

Para permitir la vigilancia de rutina y las aplicaciones de diagnóstico integrales, existe la necesidad de tecnologías de detección que se puedan ampliar para analizar muchas muestras y, al mismo tiempo, detectar múltiples patógenos individuales. Para lograr esto, los investigadores del Instituto Broad del MIT y Harvard (Cambridge, MA, EUA) desarrollaron una plataforma de diagnóstico llamada CARMEN (sigla en inglés para Reacciones Arregladas Combinadas para la Evaluación Multiplexada de Ácidos Nucleicos). El sistema CARMEN depende de gotas de nanolitros que contienen reactivos de detección de ácido nucleico basados en CRISPR/Cas 13.

Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente y separadas entre sí) son segmentos de ADN procariótico que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Cada repetición es seguida por segmentos cortos de “ADN espaciador” de exposiciones previas a un virus o plásmido bacteriano.

Los esfuerzos computacionales recientes para identificar nuevos sistemas CRISPR descubrieron un nuevo tipo de enzima dirigida al ARN, Cas13. La diversa familia Cas13 contiene al menos cuatro subtipos conocidos, incluidos Cas13a (anteriormente C2c2), Cas13b, Cas13c y Cas13d. Se demostró que Cas13a se une y escinde el ARN, protegiendo a las bacterias de los fagos de ARN y sirviendo como una plataforma poderosa para la manipulación de ARN. Se sugirió que Cas13a podría funcionar como parte de un sistema CRISPR/Cas versátil, dirigido por el ARN contra el ARN y que tiene un gran potencial para aplicaciones precisas, robustas y escalables de orientación por el ARN contra el ARN.

La plataforma CARMEN consta de un chip de goma, un poco más grande que un teléfono inteligente, que contiene decenas de miles de micropozos diseñados para contener un par de gotitas del tamaño de nanolitros. Una gota contiene material genético viral de una muestra y la otra contiene reactivos de detección de virus.

La detección de ácidos nucleicos virales se realiza mediante una modificación del protocolo SHERLOCK. Este es un método para la detección de moléculas individuales de objetivos de ácido nucleico y significa desbloqueo específico del reportero enzimático de alta sensibilidad. Funciona amplificando secuencias genéticas y programando una molécula CRISPR para detectar la presencia de una firma genética específica en una muestra, que también se puede cuantificar. Cuando encuentra esas firmas, la enzima CRISPR se activa y libera una señal robusta. Esta señal se puede adaptar para trabajar en una simple prueba de tira de papel, en equipos de laboratorio o para proporcionar una lectura electroquímica que se pueda leer con un teléfono móvil.

En la plataforma CARMEN, las gotas de nanolitros que contienen reactivos de detección de ácido nucleico basados en CRISPR se autoorganizan en la matriz de micropozos para emparejarse con las gotas de muestras amplificadas, analizando cada muestra contra cada ARN CRISPR (ARNcr) en replicado. La combinación de detección CARMEN y Cas13 (CARMEN-Cas13) permitió realizar pruebas robustas de más de 4.500 pares de ARNc-objetivo en una sola matriz. El protocolo completo, desde la extracción de ARN hasta los resultados, requirió menos de ocho horas.

Empleando el método CARMEN-Cas13, los investigadores desarrollaron un ensayo multiplexado que simultáneamente diferenciaba 169 virus asociados con humanos con más de 10 secuencias genómicas publicadas e incorporaba rápidamente un ARNcr adicional para detectar el agente causante del coronavirus pandémico COVID-19. CARMEN-Cas13 permitió además el subtipo integral de cepas de influenza A y la identificación multiplexada de docenas de mutaciones de resistencia a los medicamentos contra el VIH.

“Este enfoque miniaturizado para el diagnóstico es eficiente en recursos y fácil de implementar”, dijo el coautor principal, el Dr. Paul Blainey, profesor asociado de ingeniería biológica en el Instituto de Tecnología de Massachusetts. “Las nuevas herramientas requieren creatividad e innovación, y con estos avances en química y microfluídica, estamos entusiasmados con el potencial de CARMEN a medida que la comunidad trabaja para vencer a la COVID-19 y las futuras amenazas de enfermedades infecciosas”.

El método CARMEN-Cas13 se describió en la edición en línea del 29 de abril de 2020 de la revista Nature.

Enlace relacionado:
Instituto Broad del MIT y Harvard