Técnica de zimografía cuantitativa en gel para metaloproteinasas de matriz

Se usó una reevaluación de la técnica de zimografía cuantitativa en gel para las metaloproteinasas de matriz (MMP) en plasma humano, con el fin de compararla con los kits ELISA comercialmente disponibles.

La determinación de las MMP es relevante en numerosas condiciones fisiopatológicas, puesto que la actividad desequilibrada de las MMPs está vinculada con muchas condiciones clínicas, incluidas las enfermedades cardiovasculares, sobre todo si se asocia con la remodelación de la matriz extracelular, pero los resultados obtenidos están estrechamente relacionados con el método empleado y no son directamente comparables .

Los científicos del Consejo Nacional Italiano de Investigación (CNR, Pisa, Italia) obtuvieron muestras de sangre heparinizada de 25 voluntarios. Las muestras fueron centrifugadas y el suero fue almacenaron en alícuotas a -80°C. La zimografía en gel fue realizada, basada por electroforesis en gel de poliacrilamida, en sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) y en el uso de gelatina al 0,5% como sustrato para la detección de la actividad enzimática de las MMPs. Las actividades gelatinolíticas fueron detectadas como bandas no teñidas contra el fondo de azul de la gelatina coloreada con azul de Coomassie. Con el fin de cuantificar las concentraciones de la proteína analizada en las muestras desconocidas, se construyó una curva dosis-respuesta para cada procesamiento.

La MMP-9 total fue medida en el plasma diluido mediante un ensayo inmunométrico específico de R&D Systems (Minneapolis, MN, EUA), previamente estandarizado. El intervalo de trabajo fue de 0,19 ng/mL a 16 ng/mL; la sensibilidad fue de 0,05 ± 0,01 ng/mL y la variabilidad intra-ensayo fue de 414,3 ± 23,5 ng/mL (5,7%), mientras que la variabilidad entre los ensayos fue de menos del 15%. La concentración de MMP-9 total fue medida, en paralelo, usando la zimografía y ELISA con propósitos de comparación.

Los resultados obtenidos por el análisis de zimografía en gel, de las muestras de sangre humana, utilizando diferentes proporciones de acrilamida/bis-acrilamida, indicaron que los geles al 7,5% eran los más adecuados para la visualización de las formas de MMP-9. En todas las condiciones, se encontraron cuatro bandas de actividad gelatinolítica: MMP-9, dímeros-MMP 9 y el complejo inhibidor tisular de la metaloproteinasa1 (TIMP-1), MMP-9 y MMP-2. El curso temporal de la actividad proteolítica de las MMPs indicó que 16 a 24 horas era el tiempo óptimo de incubación y estos parámetros óptimos se utilizaron para el ensayo de rutina. Se encontró una correlación lineal positiva entre los valores de MMP-9 de zimografía y el método ELISA en donde los valores ELISA eran significativamente más bajos que los obtenidos con zimografía.

Los autores concluyeron que la principal ventaja de la zimografía en gel es que permite la visualización, tanto de las formas latentes como activas de las gelatinasas. La presencia de dímeros de MMP y complejos MMP/TIMP en las muestras de plasma, reveladas por la zimografía en gel, podría caracterizar a fondo el papel de las MMP en las enfermedades asociadas. La zimografía en gel permite la separación y visualización de las bandas MMP-2, por lo tanto que se pueden determinar tanto la MMP-2 como la MMP-9 en la misma prueba a partir de una sola muestra biológica. El estudio fue publicado en la edición de septiembre 2014 de la revista Journal of Clinical Laboratory Analysis.

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Italian National Research Council
R&D Systems