Desarrollan pruebas económicas para la esquistosomiasis basadas en LAMP

Schistosoma mansoni es la especie de más importancia causante de la esquistosomiasis intestinal humana.

Se ha demostrado que varios métodos moleculares basados en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), que incluyen la PCR convencional (cPCR), la PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR), la PCR digital por gotitas (ddPCR), son eficaces para la detección de ADN derivado del esquistosoma con más sensibilidad que los métodos parasitológicos y serológicos, especialmente en infecciones crónicas y en áreas de baja transmisión.

Los científicos de la Universidad de Salamanca (Salamanca, España) desarrollaron originalmente un método de amplificación isotérmica, mediada por bucle (LAMP), para la detección del ADN de S. mansoni (SmMIT-LAMP). Los investigadores pudieron desarrollar una mejora importante para el ensayo molecular SmMIT-LAMP, transformándolo en un formato seco de mantenimiento en frío adecuado para su posible fabricación como kit listo para usar para el diagnóstico de esquistosomiasis.

LAMP analizó el ADN de muestras de tejido de tres pacientes con infección confirmada por microscopía con S. mansoni, incluidas biopsias cutáneas y hepáticas y una biopsia de apéndice. El ADN se aisló de muestras de tejido usando el kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN, Hilden, Alemania). Las reacciones SmMIT-LAMP en tiempo real se realizaron en Tiras Genie de 8 tubos en un dispositivo Genie III portátil (OPTIGENE Ltd., Horsham, Reino Unido) a 65°C durante 60 minutos, seguido de 10 minutos a 80°C. Los amplicones se confirmaron en geles de agarosa al 1,5%, según necesidad.

El equipo informó que los resultados finales a los 65–70 minutos (contando 60 minutos para la reacción más 5–10 minutos de inactivación) se observaron claramente a simple vista al agregar el tinte fluorescente, SYBR Green I después de la amplificación. Las reacciones positivas de LAMP se volvieron verdes; de lo contrario, mantuvieron el color naranja. La correlación de los resultados colorimétricos positivos con la escalera típica de múltiples bandas en geles de agarosa fue clara.

SmMIT-LAMP en tiempo real se llevó a cabo en un dispositivo portátil usando las mismas condiciones de reacción, pero las pruebas incluyeron o no betaína en la mezcla maestra. Las reacciones en tiempo real funcionaron correctamente en ambos casos y se obtuvo una fuerte correlación entre la señal del colorante fluorescente EvaGreen y la electroforesis. Sin embargo, la eliminación de la betaína de la mezcla dio como resultado una reducción de 10 minutos en el tiempo de amplificación, al tiempo que mostró una intensidad idéntica a la de las bandas de electroforesis. Tanto las mezclas SmMIT-LAMP frescas como desecadas produjeron señales de amplificación para S. mansoni tanto en las muestras de control positivo como en las muestras de tejido. Sin embargo, se observó un retraso en la aparición de resultados positivos y una disminución en las señales de fluorescencia cuando se usan mezclas desecadas.

Los autores concluyeron que el protocolo de secado en un solo paso, es más simple y rápido que los reportados previamente y permite mantener la funcionalidad durante al menos tres semanas a temperatura ambiente y hasta cinco meses a 4°C. Su trabajo demostró una mejora importante para el ensayo molecular SmMIT-LAMP, transformado en un formato seco de mantenimiento en frío, adecuado para la fabricación como kit listo para usar para la detección de ADN de S. mansoni. El estudio fue publicado el 14 de octubre de 2019 en la revista Scientific Reports.

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OPTIGENE Ltd