Prueba rápida de amplificación de ADN detecta el Cryptosporidium en muestras de heces

Un análisis de flujo lateral RPA (Amplificación de la Polimerasa Recombinasa) detectó con rapidez y exactitud el parásito Cryptosporidium en muestras de heces.

La criptosporidiosis, una de las enfermedades transmitidas por el agua, más comunes, que se encuentran en todo el mundo; es una enfermedad parasitaria causada por el parásito protozoario Cryptosporidium. El parásito se transmite por quistes de microbianos resistentes al medio ambiente (oocitos) que, una vez ingeridos, se localizan en el intestino delgado y producen en una infección del tejido epitelial intestinal. El parásito perturba los intestinos y típicamente causa una diarrea aguda, autolimitada. En las personas inmunocomprometidas, como los pacientes con SIDA, los síntomas son particularmente graves y con frecuencia, fatales. El tratamiento es sintomático, con rehidratación con líquidos, corrección de electrolitos, y el manejo de cualquier dolor.

Los investigadores de la Universidad de Rice (Houston, TX, EUA) han desarrollado una prueba nueva de ácidos nucleicos para detectar la presencia de especies de Cryptosporidium en el ADN extraído de muestras de heces. El ensayo utiliza la técnica de amplificación isotérmica RPA para amplificar cantidades traza del ADN del patógeno extraído de las heces a niveles detectables en 30 minutos; los productos son detectados visualmente en tiras de flujo lateral simples.

La prueba de Amplificación de la Recombinasa Polimerasa (RPA) es un método, de un solo tubo, isotérmico, alternativo para el método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la aplicación de la detección del ADN. Puesto que la prueba es isotérmica, las reacciones RPA operan con equipo más sencillo que la PCR, que requiere un termociclador. El proceso RPA emplea tres enzimas principales: una recombinasa, una proteína de unión al ADN de una sopla cadena (SSB) y una polimerasa para desplazar las cadenas. Las recombinasas son capaces de aparear los cebadores de oligonucleótidos con la secuencia homóloga en el ADN dúplex. Las SSB se unen a las cadenas de ADN desplazados y evitan que los cebadores sean desplazados. Finalmente, la polimerasa que desplaza las hebras comienza la síntesis de ADN en el sitio en que el cebador se ha unido al ADN diana. Mediante el uso de dos cebadores opuestos, al igual que en la PCR, si la secuencia diana está presente, se inicia una reacción de amplificación exponencial de ADN. No se requiere ninguna otra manipulación de la muestra, como la fusión térmica o química para iniciar la amplificación. A temperaturas óptimas (37-42 grados Celsius), la reacción progresa rápidamente y produce la amplificación de ADN específico a partir de sólo unas pocas copias del objetivo hasta niveles detectables, típicamente en un tiempo de 5 a 10 minutos.

Un ensayo para Cryptosporidium basado en RPA (ensayo RPAC) fue desarrollado y optimizado utilizando el ADN de muestras de heces humanas a las que les agregaron patógenos. A continuación, las muestras fueron analizadas usando ADN extraído de las heces de los ratones infectados, y la prueba identificó correctamente la presencia o ausencia del parásito en 27 de 28 muestras de heces. Finalmente, el ensayo fue ensayado usando ADN extraído de las heces de pacientes infectados, y pudo identificar correctamente la presencia o ausencia del parásito en 21 de 21 muestras de heces.

El ensayo RPAC fue integrado en un dispositivo plegable, de papel y plástico, que permitió la amplificación de ADN con sólo el uso de pipetas, puntas de pipeta, y un calentador. El método requiere poco equipo, ya que las enzimas que amplifican el ADN funcionan mejor a la temperatura corporal o cercana a ésta. El desempeño del ensayo integrado fue comparable a, o mejor que la PCR, sin requerir el uso de un equipo termociclador. Además, las enzimas del RPA son estables en forma seca y pueden ser almacenadas de forma segura sin necesidad de refrigeración, hasta por un año.

“La diarrea es la principal causa de la mortalidad y morbilidad mundiales”, dijo el autor principal, la Dra. Rebecca Richards-Kortum, profesora de bioingeniería en la Universidad de Rice. “Los parásitos como Cryptosporidium son las causas más comunes de diarrea prolongada. Las pruebas de laboratorio actuales no son sensibles, toman mucho tiempo, y requieren una espera de días antes de que los resultados estén disponibles. Una prueba asequible, exacta, rápida, para los puntos de atención podría mejorar en gran medida la atención a las poblaciones marginadas que están más afectadas por parásitos que causan enfermedades diarreicas”.

El estudio fue publicado en la edición digital de enero 30 de 2014 de la revista Analytical Chemistry.


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Rice University