Herramienta diagnóstica LAMP para la tripanosomiasis africana

La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) es una herramienta rápida y sensible utilizada para el diagnóstico de una variedad de enfermedades infecciosas, pero todavía requiere pasos complicados para la preparación de la muestra y un laboratorio bien equipado, para producir resultados confiables y reproducibles.

Se han hecho varias modificaciones sustanciales a las técnicas LAMP para llevar a cabo el diagnóstico in situ de la tripanosomiasis africana humana (TAH) en zonas remotas donde hay normalmente laboratorios con recursos limitados en la mayoría de los países en desarrollo.

Científicos de la Universidad de Hokkaido (Sapporo, Japón) trabajando con colegas en Zambia, refinaron un sistema LAMP existente para el diagnóstico de la TAH que es rentable y estable a altas temperaturas. En su sistema, la sangre lisada se puede utilizar directamente con una alta sensibilidad de detección. Este sistema LAMP seco será de amplia aplicación en el campo o para el diagnóstico de cabecera, incluso en las zonas que carecen de infraestructura adecuada.

La primera mejora esencial es que los reactivos para la LAMP vienen secos y estabilizados en un solo tubo mediante la incorporación de trehalosa como crioprotector para prolongar la vida útil a temperatura ambiente. La segunda mejora técnica se consiguió simplificando la etapa de preparación de la muestra de modo que el ADN o el ácido ribonucleico (ARN) podía amplificarse directamente a partir de muestras de sangre lisadas con detergente. Los conjuntos de cebadores fueron evaluados mediante LAMP en tiempo real y mediante análisis de las curvas de fusión usando el termociclador Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Sídney, Australia) para controlar la reacción, y se determinaron los tiempos y la temperatura de amplificación óptimos.

Los investigadores desarrollaron una combinación de colorantes que llamaron un “indicador colori-fluorométrico (CFI) para la reacción LAMP. También desarrollaron un iluminador manual, de luces LED, con baterías, que emite una luz con una longitud de onda de 500 nm, que es adecuada para el uso en el campo o en la cabecera. Usando CFI, las reacciones LAMP podían ser detectadas de dos formas: o bien detectando los productos amplificados del ADN con GelGreen o por una disminución en la concentración de magnesio (Mg2+) con azul de hidroxilo-naftol (HNB). La fluorescencia resultante era visible con un iluminador LED azul-verde. El color del HNB cambió de violeta a azul durante la progresión de la reacción LAMP a medida que la concentración del ion Mg2+ ion disminuía por la formación de pirofosfato de magnesio insoluble. Estos cambios de color eran fácilmente visibles a la visión directa. La sensibilidad, según lo determinado por un límite de detección de diez veces era comparable al de la calceína, un reactivo de desarrollo de color comúnmente utilizado para las reacciones LAMP.

Los autores concluyeron que habían refinado el sistema de detección HA TAH T LAMP, haciendo que la reacción LAMP fuera factible para el diagnóstico de cabecera y la vigilancia en el campo. Su sistema LAMP se puede aplicar a una amplia gama de otras enfermedades infecciosas y, por tanto, allana el camino para una posible utilización de pruebas de diagnóstico molecular rápidas en los puntos de atención en los países pobres en recursos. La tripanosomiasis africana humana (THA) es una enfermedad endémica por protozoarios que afecta muchos países africanos, sobre todo en zonas rurales, donde el vector, la mosca tsetsé está presente. El estudio fue publicado el 13 de marzo de 2015, en la revista Public Library of Science Neglected Tropical Diseases.

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Hokkaido University
Corbett Research