Análisis ultrasensible detecta malaria asintomática de baja densidad

Se necesitan métodos de diagnóstico, altamente sensibles y escalables, para orientar las intervenciones con el fin de lograr la eliminación de la malaria y aunque la microscopía tradicional y las pruebas de diagnóstico rápido (PDR) son adecuadas para el diagnóstico de la infección sintomática de la malaria, se necesitan pruebas más sensibles para los programas de detección primaria de las infecciones asintomáticas de baja densidad.

Se ha desarrollado un ensayo mejorado para detectar tanto el ácido ribonucleico ribosómico (ARN) como el ADN, aprovechando, de esta manera, el alto número de copias de ARN en volúmenes pequeños de sangre, usando un reactivo de estabilización que permite la conservación de los ácidos nucleicos a partir de pequeños volúmenes de sangre, que es adecuado para la recolección por punción digital o de la oreja, con un procesamiento mínimo de la muestra y sin cadena de frío.

Científicos de la Facultad de Medicina de la Universidad de Maryland (Baltimore, MD, EUA) y sus colegas, tomaron muestras de sangre en tres municipios en el sureste de Myanmar. La sangre recolectada mediante punción digital fue utilizada para realizar la PDR Malaria Ag P.f/Pv (Standard Diagnostics; Yongin, República de Corea) inmediatamente y se colocó 0,3 ml de sangre en los tubos de recolección. Se extrajo el ácido nucleico total a partir de 200 μL de mezcla de sangre/estabilizador, usando el kit QIAamp 96 DNA para Sangre (Qiagen; Valencia, CA, EUA), pero con un volumen de elución de 50 μL de solución tampón.

Se desarrolló una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa (RT-PCR) para la detección multiplexada del gen 18S de ARN ribosomal y del ARN ribosomal del Plasmodium falciparum y Plasmodium vivax, respectivamente. Se utilizaron muestras simuladas de campo almacenados durante 14 días con solución tampón para la conservación de la muestra con el fin de evaluar la sensibilidad y especificidad, analíticas. Además, se analizaron 1.750 muestras de campo del sureste de Myanmar tanto mediante una PDR como con la RT-PCR ultrasensible, que fue realizada en una máquina de PCR en tiempo real, en un instrumento Roche Lightcycler 96 o 480 de tiempo real (Roche Diagnostics, Indianápolis, IN, EUA).

Se determinaron los límites de detección (LOD) en condiciones simuladas de campo y se encontró que este valor era de menos de 16 parásitos/mL para P. falciparum y de 19,7 copias/ μL para P. vivax (utilizando un sustituto plásmido), aproximadamente 10.000 veces menor que para la PDR. De las 1.739 muestras evaluadas exitosamente tanto por la RT-PCR ultrasensible como por la PDR, sólo dos dieron resultados positivos por la PDR, mientras que 24 dieron resultados positivos para P. falciparum, 108 dieron resultados positivos para P. vivax, y 127 dieron resultados positivos, para P. vivax y/o P. falciparum usando la RT-PCR ultrasensible.

Los autores concluyeron que el método de RT-PCR ultrasensible es un método robusto, ensayado en el campo, de detección primaria, que es mucho más sensible que las PDR. Una optimización adicional puede dar como resultado una herramienta verdaderamente escalable, adecuada para la vigilancia generalizada de la parasitemia, de bajo nivel, asintomática por P. falciparum y P. vivax. El estudio fue publicado el 23 de diciembre de 2015, en la revista Malaria Journal.

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University of Maryland School of Medicine
Standard Diagnostics
Qiagen
Roche Diagnostics