Ensayo LAMP detecta la clonorquiasis en muestras humanas

La clonorquiasis es frecuente en el Lejano Oriente y es un problema de salud importante en las áreas endémicas. Las personas infectadas pueden experimentar, si no se tratan, complicaciones graves como formación de cálculos biliares, colangitis piógena e incluso colangiocarcinoma.

El diagnóstico específico de Clonorchis sinensis es importante para el éxito del tratamiento y el control de la infección. Comúnmente se usan el método de Kato-Katz (KK) y/o la técnica de concentración de formalina-éter para el diagnóstico de la clonorquiasis. Sin embargo, los exámenes de materia fecal no son muy efectivos porque se pueden pasar por alto casos levemente infectados.

Científicos del Centro de Investigación Médica de la Universidad Nacional de Seúl (Seúl, Corea) y sus colegas, seleccionaron aleatoriamente del conjunto de muestras de heces de los residentes del condado de Sancheong en Corea, donde la clonorquiasis es endémica e investigaron los factores de riesgo y la incidencia de colangiocarcinoma entre estos residentes desde 2006. Para cada muestra de heces, se realizaron dos frotis de KK y una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real. Para el frotis de KK, se examinaron 41,7 mg de heces usando la microscopía y el resultado se multiplicó por 24 para convertirlo en huevos por gramo de heces (HPG).

Se aplicó un ensayo de amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) para la detección del ADN de Clonorchis sinensis. Se diseñaron seis cebadores dirigidos a ocho ubicaciones en el gen de la subunidad 1 de la citocromo c oxidasa de C. sinensis para la amplificación específica de especie usando el ensayo LAMP. Los productos amplificados LAMP se detectaron directamente a simple vista o colocando el tubo de reacción bajo la luz ultravioleta (sistema de documentación de Gel, UVItech, Cambridge, Reino Unido). Además, se examinaron 5,0 μL de los productos LAMP por electroforesis en un gel de agarosa al 2%, seguido de coloración con bromuro de etidio y visualización bajo luz UV.

El ensayo LAMP fue lo suficientemente sensible para detectar tan solo 100 fg de ADN genómico de C. sinensis y el límite de detección en 100 mg de heces correspondía a un solo huevo. El ensayo fue altamente específico porque no se observó reactividad cruzada con el ADN de otros helmintos, protozoos o Escherichia coli. Luego, se aplicó el ensayo LAMP a muestras de heces humanas tomadas de un área endémica de clonorquiasis en Corea. Mediante el uso de muestras que mostraban resultados consistentes, tanto por el método de Kato-Katz, como por el de PCR en tiempo real como estándares de referencia, el ensayo LAMP mostró 97.1% de sensibilidad y 100% de especificidad. En muestras de heces con más de 100 huevos por gramo de heces, la sensibilidad alcanzó el 100%.

Los autores concluyeron que habían desarrollado un ensayo LAMP altamente sensible y específico para la detección del ADN de C. sinensis en muestras fecales humanas. Debido al menor tiempo de reacción y al mejor juicio visual de positividad sin requerir instrumentos sofisticados, el ensayo LAMP se puede aplicar más fácilmente en laboratorios de campo que la PCR como una herramienta poderosa para un diagnóstico más específico y confiable de clonorquiasis, mejorando así los programas de tratamiento y control. El estudio fue publicado el 9 de octubre de 2017 en la revista Public Library of Science Neglected Tropical Diseases.