Desarrollan método de HPLC para la cuantificación de la vitamina B6

Los errores congénitos que afectan el metabolismo de la vitamina B6 se han asociado con la epilepsia dependiente de la vitamina B6.

Si bien el estado de la vitamina B6 se evalúa principalmente midiendo la forma biológicamente activa de la vitamina, el piridoxal 5-fosfato (PLP), la medición concurrente del metabolito final, el ácido 4-piridoxico (PA) puede proporcionar información adicional sobre la ingesta de suplementos y la hipofosfatasia.

Los científicos de laboratorio de la Clínica Cleveland (Cleveland, OH, EUA), desarrollaron un método de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), de fase inversa, en un solo paso, con detección de fluorescencia, mediante la evaluación de diferentes condiciones de derivatización, el uso de un solo patrón interno y diferentes estrategias de calibración. Se evaluó el desempeño analítico del ensayo. En el análisis se utilizó un sistema UHPLC, Thermal Vanquish, equipado con un detector de fluorescencia (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA).

El equipo informó que la derivatización previa de la columna con semicarbazida mostró el mejor desempeño general en términos de relación señal/ruido, tiempo de retención y forma de pico en comparación con la derivatización previa o posterior de la columna con clorita, derivatización previa de la columna o en fase móvil. utilizando bisulfito de sodio. El método final proporcionó un rango de medición analítica de 7,7-300 nmol/L para el PLP y de 3,7–300 nmol/L para el PA, una imprecisión total <15% y <5%, para el PLP y el PA respectivamente. La calibración contra el estándar del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST) produjo valores medidos dentro del 3% de los valores de PLP asignados por el NIST. El uso de 4-desoxipiridoxina como patrón interno no mejoró la precisión o la exactitud en comparación con la calibración realizada usando estándares externos de 5 niveles.

Los autores concluyeron que habían desarrollado un método simple de HPLC de un solo paso para evaluar el estado de la vitamina B6 midiendo simultáneamente el PLP bioactivo y el metabolito final, PA. El procedimiento de ensayo se simplificó en un método de un solo paso combinando la precipitación de proteínas y el procedimiento de derivatización sin comprometer el desempeño analítico. El método es lo suficientemente rápido, preciso y sensible como para detectar concentraciones de vitamina B6 por debajo del percentil 2,5 entre la población general en los Estados Unidos.

Enlace relacionado:
Clínica Cleveland
Thermo Fisher Scientific