Un método enzimático automatizado cuantifica la piruvato quinasa en los eritrocitos

Una deficiencia de la enzima piruvato quinasa (PK) en los glóbulos rojos (RBC), heredada como un rasgo autosómico recesivo, es la causa más común de anemia hemolítica no esferocítica hereditaria (HSHA). La hemólisis se debe a la incapacidad de los glóbulos rojos deficientes en PK de mantener cantidades adecuadas de ATP.

La deficiencia de piruvato quinasa (PK) afecta a menos del 1% de la población. Como la deficiencia en PK es la causa más común de HSHA, se realizan comúnmente pruebas de actividad PK para su diagnóstico. La actividad de la PK es generalmente mayor en los reticulocitos que en los glóbulos rojos maduros y puede explicar la aparición de anemia hemolítica en pacientes con actividad enzimática normal.

Los científicos del Instituto ARUP (Salt Lake City, UT, EUA), recolectaron muestras de sangre total residual en tubos que contenían EDTA o anticoagulante de heparina y las enviaron a los Laboratorios ARUP después de ser desidentificadas. Debido a que los glóbulos blancos contienen una actividad de PK 300 veces mayor que los glóbulos rojos, los dos tipos de células se separaron y el plasma se centrifugó a 9.600 g durante cinco minutos mediante el uso de aceite de ftalato en un tubo capilar de vidrio con el fin de preparar hemolizados.

La actividad de la PK se determinó utilizando un método propuesto por el Comité Internacional de Normalización en Hematología. La PK cataliza la reacción de fosfoenolpiruvato con ADP para formar piruvato y ATP. El piruvato se reduce en presencia de lactato deshidrogenasa y NADH para producir lactato y NAD+. Para el método manual, la tasa de disminución de la absorbancia a 340 nm se determinó con un espectrofotómetro Cary 60 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA) y se usó para derivar la actividad de la PK usando una absortividad molar de 6.220 L/mol/cm. Las mediciones de PK y hemoglobina (Hb) se realizaron en un analizador Roche cobas c501 (Roche Diagnostics, Basilea, Suiza).

Los científicos informaron que la exactitud del ensayo PK automatizado se evaluó comparándolo con el método manual con 56 muestras medidas en dos repeticiones durante 10 días. Las actividades de PK variaron de 1,5 a 25,9 U/g de Hb, y la regresión lineal produjo una pendiente con un valor de R2 = 0,93, lo que indica que los dos métodos produjeron los mismos resultados. La precisión se evaluó probando hemolizados en tres réplicas/día durante 10 días. La imprecisión dentro del experimento fue de 1,9% y 2,5% y la imprecisión total fue de 4,0% y 5,6% a 14,0 y 8,1 U/g de Hb, respectivamente. El límite de blanco fue 0,0, y el límite de detección fue de 1,0 U/dL. La estabilidad se determinó en cuatro tipos de muestra a tres temperaturas diferentes; todos los cambios fueron menos del 10% en comparación con t0. Se verificó el intervalo de referencia para la PK actualmente en uso de 4,6 a 11,2 U/g de Hb.

Los autores concluyeron que la capacidad de medir ambos componentes en una única plataforma automatizada y en el mismo hemolizado es un método eficiente para reemplazar un ensayo de actividad manual con el uso de dos plataformas analíticas diferentes. El estudio fue publicado en la edición de enero de 2020 de la revista The Journal of Applied Laboratory Medicine.

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