Prueba no invasiva de orina para la predicción de la falla del trasplante renal

Una prueba no invasiva que predice un posible fracaso del trasplante de riñón combina la herramienta de edición de genes, CRISPR, con un procedimiento de lectura visual de flujo lateral para analizar muestras de orina de los receptores de trasplante.

Los investigadores del Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (Berlín, Alemania) diseñaron un sistema nuevo de análisis que detecta dos virus oportunistas comunes que infectan a los pacientes con trasplante de riñón, el citomegalovirus (CMV) y el poliomavirus BK (BKV), y para el ARNm de CXCL9, cuya expresión aumenta durante el rechazo celular agudo del trasplante de riñón.

La primera etapa del ensayo amplifica el ADN o ARN en la muestra de orina para que CRISPR lo pueda detectar. Los CRISPR (repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente y separadas entre sí) son segmentos de ADN procariota que contienen repeticiones cortas de secuencias de bases. Cada repetición es seguida por segmentos cortos de “ADN espaciador” de exposiciones previas a un virus o plásmido bacteriano. Desde 2013, se ha utilizado el sistema CRISPR/Cas9 en la investigación para la edición de genes (agregando, interrumpiendo o cambiando la secuencia de genes específicos) y la regulación de genes. A través de la administración de la enzima Cas9 y los ARN guía apropiados (sgARN) a una célula, el genoma del organismo se puede cortar en cualquier ubicación deseada. El sistema convencional CRISPR/Cas9 de Streptococcus pyogenes se compone de dos partes: la enzima Cas9, que escinde la molécula de ADN y guías de ARN específicas que guían la proteína Cas9 al gen objetivo en una cadena de ADN.

Los esfuerzos computacionales recientes para identificar nuevos sistemas CRISPR descubrieron un nuevo tipo de enzima dirigida contra el ARN, Cas13. La diversa familia Cas13 contiene al menos cuatro subtipos conocidos, incluidos Cas13a (anteriormente C2c2), Cas13b, Cas13c y Cas13d. Se demostró que Cas13a se une y escinde el ARN, protegiendo a las bacterias de los fagos de ARN y sirviendo como una plataforma poderosa para la manipulación de ARN. Se sugirió que Cas13a podría funcionar como parte de un sistema CRISPR/Cas versátil, dirigido al ARN guiado por el ARN, que tiene un gran potencial para aplicaciones precisas, robustas y escalables de selección de ARN y de ARN guiado.

Después del paso de amplificación de ADN/ARN, los investigadores aplicaron el protocolo SHERLOCK de SHERLOCK Biotechnologies (Cambridge, MA, EUA). Este es un método usado para la detección de moléculas individuales de objetivos de ácido nucleico y significa desBLOQueo (unLOCKing, en inglés) del Reportero Enzimático Específico de Alta Sensibilidad. El método funciona amplificando secuencias genéticas y programando una molécula CRISPR para detectar la presencia de una firma genética específica en una muestra, que también puede ser cuantificada. Cuando encuentra esas firmas, la enzima CRISPR se activa y libera una señal robusta. Esta señal se puede adaptar para trabajar en una simple prueba de tira de papel, en equipos de laboratorio, o para proporcionar una lectura electroquímica que se pueda leer con un teléfono móvil.

El análisis de flujo lateral usando una tira de papel se utilizó para convertir el contenido de la muestra tratada en un resultado fácilmente visualizable. Una línea que aparece en la tira es un resultado negativo, mientras que dos líneas indican que hay un virus presente. Se usó un proceso similar para CXCL9. El mARN se aisló y amplificó, seguido de la detección de objetivo mediada por CRISPR/Cas13.

Los investigadores utilizaron el sistema de análisis para analizar más de 100 muestras de pacientes con trasplante de riñón. Los resultados revelaron que la prueba detectó con precisión el ADN del poliomavirus BK y el ADN del citomegalovirus de muestras de sangre y orina derivadas de los pacientes, así como el ARN mensajero para CXCL9 a niveles elevados en muestras de orina de pacientes que experimentaron un rechazo agudo de trasplante de riñón.

“La mayoría de las personas piensan en la edición de genes cuando piensan en CRISPR, pero esta herramienta tiene un gran potencial para otras aplicaciones, especialmente diagnósticos más baratos y rápidos”, dijo el primer autor, el Dr. Michael Kaminski, jefe del laboratorio de ingeniería de células renales y diagnóstico CRISPR en el Centro Max Delbrück de Medicina Molecular. “El desafío es llegar a concentraciones que sean clínicamente significativas. Realmente hace una gran diferencia si se busca una tonelada de objetivo sintético en su tubo de ensayo, en comparación con si se quiere llegar al nivel de molécula única en el fluido de un paciente”.

El ensayo para determinar el rechazo del trasplante de riñón se describió en la edición en línea del 13 de abril de 2020 de la revista Nature Biomedical Engineering.

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Centro Max Delbrück de Medicina Molecular
SHERLOCK Biotechnologies