Realizan genotipificación mediante FRET-PCR sin extracción de ADN

Se usan ampliamente muestras de sangre para el diagnóstico molecular de muchas enfermedades hematológicas usando toda clase de técnicas, basadas en la amplificación de los ácidos nucleicos.

Los métodos actuales para las reacciones en cadena de la polimerasa (PCR) usan ADN genómico, purificado, principalmente aislado de las células de la sangre periférica o leucocitos (WBC), los cuales pueden ser mejorados por un método basado en la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia, en tiempo real, para la genotipificación directa de las células sanguíneas.

Los hematólogos en el Hospital Universitari Son Espases (Palma de Mallorca, España) estudiaron la sangre periférica de 34 pacientes, la cual fue recolectada en tubos que contenían ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Entre las muestras, los científicos incluyeron una mezcla de alelos mutantes para los pacientes que sufren de trombosis o de hemocromatosis hereditaria. A continuación, se lisaron los glóbulos rojos (GR) y se aislaron las células blancas de la sangre (glóbulos blancos). Posteriormente, se realizó una PCR en tiempo real, seguida por un análisis de la curva de fusión para diferentes genes, incluyendo la metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR), la hemocromatosis (HFE), el factor de coagulación V de Leiden (F5), el factor de protrombina dos (F2) y el factor XII de la coagulación (F12).

La PCR en tiempo real se realizó en el Instrumento LightCycler 2.0 (Roche Diagnostics Corporation, Indianápolis, IN, EUA). Con el fin de estandarizar las muestras para la reacción de PCR en tiempo real, las células fueron contadas en un contador automatizado de células, Scepter 2,0 (Merck Millipore, Billerica, MA, EUA) y las muestras fueron ajustadas a 5 × 106 células/mL. Después de analizar 34 muestras comparando los valores del punto de cruce (PC) en tiempo real entre 5 × 106 leucocitos/ml y 20 ng/ µL de ADN purificado, los resultados para F5 Leiden fueron los siguientes: valor medio de PC para WBC fue 29,26 ± 0,57 frente a ADN purificado, 24,79 ± 0,56. Hubo un retraso observado de cerca de cuatro ciclos cuando se realizó la PCR a partir de WBC, en lugar de ADN.

Los autores llegaron a la conclusión de que su protocolo obvia la etapa de purificación de ADN, ahorrando, así, tiempo y recursos. Además, puesto que la manipulación que se le realiza a la muestra es mínima, se puede disminuir el riesgo de contaminación. A medida que se informaron los resultados de una variedad de genes, ellos sostienen que su protocolo será adecuado para la determinación del genotipo de casi cualquier polimorfismo heredado. El estudio fue publicado el 25 de junio de 2014, en la revista Journal of Blood Medicine.

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Hospital Universitari Son Espases
Roche Diagnostics Corporation
Merck Millipore