Análisis que mide ocho marcadores de citoquinas discrimina entre forma activa y latente de tuberculosis

Un nuevo análisis de PCR de transcripción reversa, en tiempo real (rt-RT-PCR) permite que los diagnosticadores diferencien entre la tuberculosis primaria activa (TB) y la forma latente de la enfermedad (LTBI), que son estados de la enfermedad que no se pueden diferenciar por la prueba dérmica de la tuberculina (TBT) o los análisis de liberación de interferón gamma (IGRAs).

Investigadores de la Universidad de Yonsei (República de Corea; www.yonsei.ac.kr) desarrollaron un PCR, de transcriptasa reversa, en tiempo real TaqMan para la determinación de los niveles de ocho objetivos humanos [IFN-gamma, factor de necrosis tumoral (TNF) alfa, IL-2R, IL-4, IL-10, CXCL9, CXCL10, y CXCL11].

Los ensayos TaqMan se basan en sondas de oligonucleótidos que constan de un fluoróforo unido covalentemente al extremo 5' de la sonda y de un extintor en el extremo 3'. La molécula extintora apaga la fluorescencia emitida por el fluoróforo cuando es excitado por la fuente de luz del ciclador a través de FRET (Transferencia de Energía de Resonancia Fluorescente). Mientras el fluoróforo y el extintor están en proximidad, la extinción inhibe cualquier señal de fluorescencia. Las sondas TaqMan están diseñadas, de tal manera, que se anillan dentro de una región de ADN amplificada por un conjunto específico de cebadores. A medida que la Taq polimerasa extiende el cebador y sintetiza la hebra naciente, la actividad de La exonucleasa 5' a 3' de la Taq polimerasa degrada la sonda que se ha hibridado con la plantilla. La degradación de la sonda libera el fluoróforo y rompe la estrecha proximidad con el inhibidor de la fluorescencia, aliviando así el efecto de extinción y permitiendo la fluorescencia del fluoróforo. Por lo tanto, la fluorescencia detectada en el termociclador PCR cuantitativo, es directamente proporcional al fluoróforo liberado y la cantidad de molde de ADN presente en la PCR.

Los resultados obtenidos con el ensayo TaqMan de tuberculosis, mostraron que la sensibilidad de TNF-alfa, IL-2R, y CXCL10 en el grupo de tuberculosis pulmonar (PTB) activa era del 96,43%, 96,43% y 100%, respectivamente. La sensibilidad de IL-2R y CXCL10 en el grupo de la tuberculosis latente fue 86,36% y 81,82%, respectivamente. Los resultados estadísticos mostraron que el TNF-alfa y el CXCL9 eran los mejores marcadores individuales para diferenciar entre la PTB, la LTBI y los grupos no-TB.

Para la sensibilidad y la diferenciación, óptimos, del estado de infección por M. tuberculosis, los investigadores intentaron la detección simultánea de múltiples objetivos. La combinación de IFN-gamma, TNF-alfa e IL-2R, y la combinación de TNF-alfa, IL-2R, CXCL9 y CXCL10 mostró el mejor desempeño para la detección de PTB activa (ambos con 100% de positividad) y LTBI (86,36% y 81,82% de positividad, respectivamente).

“Estos resultados implican que una combinación de marcadores individuales adecuados es muy útil para el diagnóstico eficiente y para la diferenciación de la infección por Mycobacterium tuberculosis (MTB)”, dijo el autor principal, el Dr. Hyeyoung Lee, profesor de ciencias biomédicas de laboratorio en la Universidad de Yonsei. “La Organización Mundial de la Salud informa que un tercio de la población mundial tiene una infección latente con MTB. Se ha calculado que en 5% a 10% de los individuos LTBI, la infección progresa a un estado de enfermedad activa, y la tasa de conversión es mayor en individuos inmunodeprimidos, como las personas con VIH. Por lo tanto, las pruebas de diagnóstico rápido y el tratamiento eficaz de la LTBI son importantes para reducir y controlar la carga de TB”.

Los detalles del estudio fueron publicados en la edición de enero de 2015 de la revista Journal of Molecular Diagnostics.


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Yonsei University