Secuenciación del viroma con captura permite diagnóstico sensible de los virus

Su poca sensibilidad y su complejidad técnica han impedido la implementación de la secuenciación de ácidos nucleicos de alto rendimiento para el diagnóstico diferencial de las infecciones virales en los laboratorios clínicos.

Un método revolucionario para hacer pruebas genéticas, que es tan sensible como el estándar de oro, el análisis por reacción en cadena de la polimerasa, permite detectar de forma simultánea cientos de virus diferentes y proporciona la secuencia casi completa de su genoma, lo cual permite asegurar que los médicos tendrán una nueva y poderosa herramienta para detectar y tener la secuencia de los virus.

Unos científicos de la Universidad de Columbia (Nueva York, Nueva York, EUA) generaron facsímiles de muestras clínicas en un fondo de ácidos nucleicos (NA) extraídos de tejido normal humano de pulmón, de sangre con EDTA y de suero. A esas muestras se les agregó NA viral y se cuantificaron empleando PCR con TaqMan (transcripción inversa) en tiempo real (qPCR) específica para los virus. Ellos desarrollaron una plataforma para Captura y Secuenciación del Viroma para los virus de los Vertebrados (VirCapSeq-VERT), que permite la detección simultánea de cientos de diferentes virus y proporciona la secuencia casi completa de sus genomas.

Las muestras clínicas incluyeron una muestra de hisopo nasal humano que se sabía que era positiva para el Enterovirus D68 (EV-D68) y muestras de suero de unos pacientes hemofílicos infectados con el virus de la hepatitis C (HCV), el virus C deGB (GBV-C), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y el virus de teno torque (TTV). Se extrajeron NA de muestras de cultivos de células, de sangre, de suero y de tejido, utilizando el sistema easyMAG (bioMérieux; Marcy l'Etoile, Francia) y los kits AllPrep para ADN y ARN (Qiagen; Hilden, Alemania). Los productos para PCR fueron purificados utilizando perlas Agencourt Ampure para purificación del ADN (Beckman Coulter, Brea, CA, EUA) y se cuantificaron mediante la secuenciación de Illumina.

El uso de VirCapSeq-VERT produjo un aumento de 100 a 10.000 veces en la lectura de partículas virales en los homogeneizados de sangre y de los tejidos, en comparación con la secuenciación convencional de Illumina, usando los procedimientos establecidos para el enriquecimiento en virus, como la filtración, tratamientos con nucleasa y extracción del ácido ribonucleico ribosomal (rARN) con RiboZero. El VirCapSeq-VERT mostró un límite de detección comparable con el de la PCR en tiempo real específica para cada agente en los extractos de suero, sangre y tejido. Además, el método identificó nuevos virus cuyos genomas fueron diferentes, en cerca de un 40 %, de los genomas de los virus conocidos que se utilizaron para el diseño de la biblioteca de sondas. La plataforma VirCapSeq-VERT es ideal para el análisis de la composición y la dinámica del viroma.

Thomas Briese, PhD, profesor y autor principal del estudio, dijo: “Si se tiene un paciente con sospecha de sufrir una enfermedad viral se puede ahora, por una cantidad muy razonable de dinero, caracterizar con certeza todos los virus presentes en ese paciente, con el fin de averiguar la forma como debe ser tratado”. VirCapSeq-VERT cuesta aproximadamente USD 40 para hacer las pruebas de 20 pacientes o muestras, lo cual se compara favorablemente con otros procedimientos como el agotamiento de rARN, que cuestan alrededor de 65 dólares por muestra. El estudio fue publicado el 22 de septiembre de 2015, en la revista mBIO.

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Columbia University
bioMérieux
Qiagen
Beckman Coulter