Características genómicas de la leucemia pediátrica pueden ser identificadas mediante NGS

Las leucemias pediátricas tienen un panorama genómico diverso asociado con variantes estructurales complejas, que incluyen fusiones, inserciones y deleciones de genes, y variantes de un solo nucleótido. Las técnicas rutinarias de cariotipo e hibridación fluorescente in situ (FISH) carecen de sensibilidad para poder detectar las alternancias genómicas más pequeñas.

La enfermedad residual mínima (ERM; más bien llamada Enfermedad Residual Medible) es la detección de leucemia residual después de la terapia, más comúnmente por citometría de flujo. La ERM, medida por citometría de flujo multiparamétrica, es quizás uno de los predictores más importantes de resultados en niños con leucemia mieloide aguda.

Los hematólogos del Hospital para Niños Nemours/Alfred I. duPont (Wilmington, DE, EUA) y sus asociados, recogieron 32 muestras primarias de médula ósea de leucemia pediátrica y cinco individuos adultos con leucemia, la línea celular MV4-11 y una muestra de cordón umbilical. Se recogieron muestras de pacientes en el momento del diagnóstico, al final del primer tratamiento y al momento de la recaída. Las muestras de Nemours consistieron en seis individuos con leucemia mieloide aguda (LMA), un individuo con leucemia promielocítica aguda (LPA), 17 sujetos con leucemia linfoide aguda (LLA) de células preB y tres sujetos con LLA de células T.

El ácido nucleico se extrajo de cada muestra. El ADN se extrajo usando el kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, Germantown, MD, EUA). La cantidad y calidad del ácido nucleico se evaluó con la TapeStation 4200 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA). Para optimizar la detección de variantes estructurales y de número de copias en ADN y ARN en genes más estrechamente relacionados con la leucemia pediátrica, el equipo preparó bibliotecas de secuenciación con corrección de errores de ADN (ECS) utilizando un kit VariantPlex personalizado (ArcherDx, Boulder, CO, EUA) o un ensayo de transcriptoma de cáncer humano.

Los científicos informaron que, de manera similar a la citometría de flujo para la ERM en la LLA, el límite de detección (LOD) para mutaciones puntuales por sus estrategias de secuenciación fue de ≥0,001. Para las variantes estructurales de ADN, la línea celular positiva de duplicación en tándem interno FLT3 (ITD) y las muestras de pacientes, mostraron un LOD de ≥0,001 además de pérdidas de número de copias previamente desconocidas en los genes de leucemia. La ECS en el ARN identificó múltiples fusiones de genes nuevos, incluida una fusión de genes SPANT-ABL en un paciente con LLA, que se podría haber usado para alterar la terapia.

Colectivamente, la ECS para ARN demostró un panorama cuantitativo y complejo de moléculas de ARN con el 12% de las moléculas representando fusiones de genes, 12% duplicaciones de exones, 8% deleciones de exones y 68% intrones retenidos. La validación de la reacción en cadena de la polimerasa digital en gotas de ARN-ECS confirmó los resultados hasta cantidades de moléculas de ARNm individuales.

Los autores concluyeron que, colectivamente, los ensayos permitieron un análisis altamente sensible, integral y simultáneo de varias mutaciones leucémicas clonales, que pueden rastrearse a través de estados de enfermedad (diagnóstico, final de la inducción y recaída) con un alto grado de sensibilidad. El estudio fue publicado el 4 de marzo de 2020 en la revista BMC Medical Genomics.

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Hospital para Niños Nemours/Alfred I. duPont
Qiagen
Agilent Technologies
ArcherDx