ADN genómico de muestras fecales ayuda a identificar la ECEH

El examen de alto rendimiento de patógenos en muestras de heces identifica la Escherichia coli enterohemorrágica (ECEH) responsable de la epidemia de diarrea sanguinolenta asociada con el síndrome urémico hemolítico (SUH) que brotó en Alemania.

El sistema automatizado de preparación de muestras puras MagNA para separación de ácidos nucleicos y el LightCycler para reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR) de Roche Applied Science (Penzberg, Alemania) fueron utilizados para el examen de alto rendimiento de ECEH patógenas en muestras primarias de heces durante la epidemia de E. coli.

En un estudio llevado a cabo por Ralf Bialek [Laboratorio del Dr. Krause y sus colegas] (MVZ GmbH, Kiel, Alemania), las muestras de heces fueron procesadas en la estación de trabajo de alto rendimiento MagNA Pure 96, aislando ADN total de alta calidad de muestras fecales primarias. Enfocándose en los genes de toxinas de ECEH con PCR en tiempo real en un LightCycler se demostró que las muestras de materia fecal pueden utilizarse como material de partida para detectar la infección por ECEH en situaciones de epidemia, reduciendo la incubación, de una noche a unas horas.

El instrumento robótico totalmente automatizado MagNA Pure 96 usado en este estudio separa los ácidos nucleicos de 96 muestras en aproximadamente una hora. La plataforma de Roche es una manera, eficiente y rentable, de preparar la plantilla de ADN de un gran número de muestras de heces en situaciones de epidemia. El PCR en tiempo real posterior con LightCycler 480 resultó ser exacto y reproducible utilizando sondas y cebadores probados, específicos y sensibles de PCR dirigidos contra los genes de la toxina Shiga de la ECEH, disponible en el kit LightMix EHEC.

Se estableció un nuevo protocolo universal para patógenos con un volumen de 200 µL de muestra y un volumen de elución de 100 µL. Los genes de la toxina Shiga de E. coli fueron amplificados en presencia de dos pares de sondas de hibridación marcadas con fluorescencia y dirigidas contra stx-1 y stx 2, siguiendo con el análisis de la curva de fusión en el sistema LightCycler para diferenciar el subtipo de gen de la toxina. El gen bacteriano parC (que codifica la subunidad IV de la topoisomerasa de Enterobacteriaceae) fue utilizado como control de la extracción para demostrar la presencia de ADN extraído y para excluir los inhibidores de la PCR. Pruebas sistemáticas de este flujo de trabajo contribuirán en gran medida a la detección precoz y la vigilancia de futuras infecciones por ECEH y de nuevas epidemias bacterianas.

El equipo evaluó un nuevo análisis múltiple de cuatro colores con sondas de hidrólisis para el LightCycler 480 dirigidas a los genes de ambas toxinas (stx1 y stx2), al gen wzx (marcador para el serotipo O104) y a un control interno. Este nuevo ensayo permite analizar muestras sospechosas en una sola reacción, en un tiempo menor y de modo más rentable, que es un factor de importancia especial durante un brote, cuando se deben estudiar muchas muestras en poco tiempo.

Se han reportado más de 3.400 casos de ECEH y SUH confirmadas por el laboratorio, 39 de ellos con resultados fatales según un informe del 20 de junio de 2011 del Instituto Robert Koch (Berlín, Alemania; www.rki.de). La mayoría de personas infectadas con ECEH viven en Alemania, pero un número significativo ha sido reportado también en Suecia, Rusia y otros países europeos.

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Roche Applied Science

Robert Koch Institute