Sonda funcional doble para hibridización de ADN y análisis de punto de fusión

Investigadores japoneses han descrito un nuevo método para combinar la amplificación mediante PCR, en tiempo real, y el análisis de curva de fusión, en una reacción en un solo tubo, lo cual suministra un medio poderoso para nuevos análisis de detección de mutaciones.

Esta tecnología, desarrollada conjuntamente por el Centro para Tecnología de Ciencias de la Vida RIKEN (Saitama, Japón) y K.K. DNAFORM (Ciudad de Yokohama, Japón), permitirá el desarrollo de nuevos ensayos avanzados para pruebas genéticas basadas en el ADN y debe ayudar a llevar los beneficios de los estudios de secuenciación de todo el genoma a los pacientes en la clínica.

La nueva metodología se basa en la Eprobe de RIKEN, una sonda fluorescente altamente eficiente y confiable. Las Eprobes contienen dos porciones de colorante unidas al mismo nucleótido, y sus señales fluorescentes están fuertemente reprimidas como oligonucleótidos de cadena sencilla por una interacción excitónica entre los colorantes. Tras la hibridación a una cadena de ADN complementaria, los colorantes se separan y se intercalan en la doble cadena produciendo fuertes señales de fluorescencia. Además, la intercalación de los colorantes estabiliza aún más el ADN/ADN híbrido y aumenta la temperatura de fusión en comparación con los oligonucleótidos estándar de ADN. Por lo tanto, las Eprobes permiten la monitorización, en tiempo real, de la amplificación específica y, a la vez, permite el estudio de los productos de reacción por análisis de la curva de fusión.

En un estudio reciente, los investigadores utilizaron Eprobes para la detección de variaciones genéticas en un tumor humano EGFR (receptor del factor de crecimiento epidérmico) y KRAS (homólogo del oncogén Kirsten viral del sarcoma de rata, V-Ki-ras2). Los investigadores demostraron que las Eprobes proporcionan ventajas decisivas sobre las sondas de hibridación utilizadas, debido a su única reducción de la señal de fondo, una mayor afinidad de unión al ADN y una muy baja tasa de falsos positivos.

“Estamos muy entusiasmados con el potencial de las nuevas Eprobes”, dijo el Dr. Matthias Harbers, un científico visitante en el Centro de Ciencias de la Vida RIKEN. “En las reacciones, las Eprobes actuaron como colorantes fluorescentes específicos de secuencia, lo que les confiere un gran potencial para su uso como sondas de hibridación no sólo en la PCR y el análisis de la curva de fusión, sino también en otras aplicaciones importantes como, por ejemplo, en hibridación fluorescente in situ o FISH”.

El estudio Eprobe fue publicado en la edición digital del 7 de agosto 2013, de la revista PLoS ONE.

Enlaces relacionados:

RIKEN Center for Life Science Technologies

K.K. DNAFORM