Plataforma de análisis basada en CRISPR detecta múltiples virus y variantes de la COVID-19

Investigadores del Instituto Broad del MIT y la Universidad de Harvard (Cambridge, MA, EUA) y la Universidad de Princeton (Princeton, NJ, EUA) describieron el desarrollo de la plataforma de diagnóstico conocida como mCARMEN (Reacciones en Hilera Combinatorias microfluídicas para la Evaluación Multiplexada de ácidos Nucleicos). La plataforma mCARMEN es una versión mejorada y refinada de su sistema CARMEN, que dependía de gotas de nanolitros que contenían reactivos de detección de ácidos nucleicos basados ​​en CRISPR/Cas 13.

Esfuerzos computacionales recientes para identificar nuevos sistemas CRISPR descubrieron un nuevo tipo de enzima dirigida contra el ARN, Cas13. La diversa familia, Cas13, contiene al menos cuatro subtipos conocidos, incluidos Cas13a (anteriormente C2c2), Cas13b, Cas13c y Cas13d. Se demostró que Cas13a se une y escinde el ARN, protegiendo a las bacterias de los fagos de ARN y sirviendo como una plataforma poderosa para la manipulación del ARN. Se sugirió que Cas13a podría funcionar como parte de un sistema CRISPR/Cas de orientación de ARN versátil y guiado por ARN que tiene un gran potencial para aplicaciones dirigidas contra ARN guiadas por ARN, precisas, robustas y escalables.

La plataforma CARMEN original requería un equipo personalizado, implicaba un flujo de trabajo manual intensivo de ocho a 10 horas y ofrecía una eficiencia demasiado baja para los requisitos de una pandemia. Por lo tanto, los investigadores modificaron el procedimiento CARMEN para que funcionara en la plataforma de instrumentación y microfluidos Fluidigm (San Francisco, CA, EUA), facilitando su ejecución y reduciendo el tiempo de procesamiento a la mitad. Los investigadores también optimizaron el flujo de trabajo para una mayor sensibilidad, de modo que pudiera detectar patógenos en muestras con menos material genético. Además, al usar las enzimas Cas12 y Cas13, basadas en CRISPR, en combinación, mCARMEN no solo pudo detectar la presencia de un virus, sino que también midió la cantidad de virus en una muestra.

Para complementar el protocolo mCARMEN, los investigadores desarrollaron un panel de virus respiratorios (RVP) para analizar hasta 21 virus, incluido el SARS-CoV-2, otros coronavirus y ambas cepas de influenza, y demostraron su desempeño de grado diagnóstico en 525 muestras de pacientes en un entorno académico y 166 especímenes en un entorno clínico. Además, desarrollaron un panel mCARMEN para permitir la identificación de seis linajes variantes del SARS-CoV-2, incluidos delta y ómicron, y lo evaluaron en 2.088 muestras de pacientes. Finalmente, implementaron un enfoque combinado Cas13 y Cas12 que permitió la medición cuantitativa de SARS-CoV-2 y copias virales de influenza A en las muestras.

“La pandemia de COVID-19 nos muestra que necesitamos más pruebas, con más frecuencia, particularmente al principio de una pandemia”, dijo el autor principal, el Dr. Cameron Myhrvold, profesor asistente de biología molecular en la Universidad de Princeton. “COVID-19 nos muestra que seguirán surgiendo virus desafiantes, por lo que debemos seguir buscándolos y encontrar mejores formas de hacerlo”.

El método mCARMEN se describió en la edición en línea del 7 de febrero de 2022 de la revista Nature Medicine.

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Instituto Broad del MIT y la Universidad de Harvard
Universidad de Princeton
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