Factores que afectan análisis del ADN en plasma

Existe un gran potencial en los métodos de medicina de precisión tanto para detectar como para monitorizar enfermedades al buscar indicios de mutaciones cancerosas en el ADN libre de células (ADNc), circulante en la sangre. Sin embargo, hay muchos factores que pueden alterar significativamente estas muestras a medida que se obtienen y analizan.

El análisis del ADN tumoral circulante (ADNc) se basa en la detección y cuantificación de estas mutaciones, en un contexto de ADNc aportado por las células de la sangre periférica y otros tejidos. Los niveles de ADNc total y de ADNct específico del tumor en el plasma varían considerablemente entre los pacientes con cáncer, los tipos de cáncer y las etapas de la enfermedad, así como durante el seguimiento longitudinal de cada paciente.

Científicos del Instituto de Investigación Genómica Traslacional (Phoenix, AZ, EUA), diseñaron un ensayo de reacción en cadena de la polimerasa digital de gotitas multiplexadas (ddPCR) dirigido a nueve locus genómicos de copia única. Prepararon reacciones de PCR digital y realizaron un termociclado con DNA Engine Tetrad 2 (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA) y midieron la fluorescencia de las gotas utilizando el instrumento RainDrop Digital PCR Sense (RainDance Technologies, Lexington, MA, EUA) y luego analizaron los resultados utilizando el software acompañante. Para evaluar si su ensayo de ddPCR se realizó como se esperaba, analizaron cantidades conocidas de fragmentos de ADN cortados con un tamaño predeterminado y compararon los resultados con los rendimientos teóricos esperados.

Se recogieron muestras de voluntarios sanos y de plasma clínico que se compararon con muestras procesadas inmediatamente y otras que estaban archivadas. Las muestras de siete cohortes clínicas independientes se incluyeron en este análisis, incluidas de pacientes diagnosticados con melanoma, colangiocarcinoma y cáncer de recto, así como de voluntarios sanos. Para la evaluación del desempeño de la secuencia guiada por los resultados de ddPCR, el equipo cuantificó el cfADN de muestras de plasma de control obtenidas comercialmente usando ddPCR y preparó bibliotecas de secuenciación del genoma completo usando ThruPLEX DNA-Seq (Rubicon Genomics, Ann Arbor, MI, EUA).

Los científicos evaluaron los efectos de los métodos de extracción de ADN y los tubos de extracción de sangre sobre el rendimiento de cfADN y el tamaño del fragmento, y desarrollaron un ensayo de PCR digital de gotitas multiplexadas (ddPCR) con cinco amplicones cortos y cuatro largos, dirigidos a loci genómicos de copia única. Usando este ensayo, compararon siete kits de extracción de cfADN y encontraron que el rendimiento de cfADN y el tamaño del fragmento variaban significativamente. También compararon tres protocolos de recolección de sangre utilizando muestras de plasma de 23 voluntarios sanos (tubos con EDTA procesados en máximo una hora y tubos de recolección de ADN sin células, procesados en plazos máximos de 24 y 72 horas) y no encontraron diferencias significativas en el rendimiento de ADNc, el tamaño del fragmento y el ruido de fondo entre estos protocolos. En 219 muestras clínicas, los fragmentos de cfADN fueron más cortos en las muestras de plasma procesadas inmediatamente después de la punción venosa en comparación con las muestras archivadas, lo que sugiere que existe una contribución del ADN de fondo por las células sanguíneas periféricas lisadas.

Muhammed Murtaza, MD, PhD, autor principal del estudio, dijo: “Para que podamos confiar en los resultados de la secuenciación y la evidencia de mutaciones cancerosas de estas muestras y para hacer recomendaciones válidas para los médicos tratantes, debemos asegurarnos de que las muestras hayan sido recolectadas y procesadas apropiadamente. Desarrollamos este nuevo ensayo de control de calidad para asegurar que podamos confirmar la confiabilidad utilizando un volumen muy pequeño de la muestra de sangre de un paciente”. El estudio fue publicado el 9 de mayo de 2018 en la revista Scientific Reports.