Detectan ARN del SARS-CoV-2 en tejido FFPE mediante PCR digital por gotitas

La infección por SARS-CoV-2 puede provocar diversas patologías multiorgánicas, siendo las más significativas las de los pulmones, el corazón, los riñones, el sistema nervioso central, el hígado, los ganglios linfáticos, la médula ósea, los vasos sanguíneos, el intestino y la placenta.

La infección por SARS-CoV-2 generalmente se identifica mediante la detección de ARN viral a través de la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-qPCR) en hisopados nasofaríngeos u orofaríngeos. A los pacientes con infección actual o previa por SARS-CoV-2, que presenten insuficiencia respiratoria aguda o crónica “inexplicable” u otras manifestaciones específicas de órganos, les pueden realizar una biopsia de tejido.

Un equipo de diagnosticadores de la Clínica Mayo (Rochester, MN, EUA), desarrolló y validó mediante PCR digital por gotitas (ddPCR, una prueba cualitativa para la detección de SARS-CoV-2) en tejidos incluidos en parafina y fijados en formol (FFPE). Se utilizaron, para el estudio, 37 muestras de tejido provenientes de 35 casos de autopsia (20 positivos, 15 negativos), un bloque celular de una línea celular infectada con el SARS-CoV-2 y un bloque celular de una línea celular infectada con el virus de la influenza, para determinar la exactitud, la precisión, la estabilidad, la linealidad y la especificidad.

El ARN total, incluido el ARN viral, se extrajo de rollos de tejido FFPE, sin teñir, cortados a 10 µm, con el kit RNeasy DSP FFPE o el kit miRNeasy FFPE (Qiagen, Hilden, Alemania). El ARN se cuantificó, en un rango de 12 a 800 ng/μL, y se almacenó a -80°C. El ensayo se realizó con la prueba Bio-Rad SARS-CoV-2 ddPCR (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA). Las muestras de ARN se analizaron tanto puras como a una dilución de 1:100. Después de dividir la reacción en gotitas usando el instrumento Bio-Rad AutoDG, las secuencias objetivo de la nucleocápside (N1 y N2) del SARS-CoV-2, junto con el objetivo de la subunidad 30 de la ribonucleasa P/MRP humana (RPP30) como control, se amplificaron mediante el termociclador Veriti de Applied Biosystems (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, EUA).

Los científicos informaron que se detectó SARS-CoV-2 en las 21 muestras positivas conocidas y en ninguna de las 16 muestras negativas. Se detectaron de manera confiable a partir de solo aproximadamente cinco copias virales. Desde enero de 2021, se han analizado clínicamente muchos tipos de tejidos. De las 195 muestras clínicas, la tasa de positividad fue del 35 % y la placenta y el tejido fetal mostraron el mayor porcentaje de casos positivos. Tanto las mediciones intraensayo como interensayo fueron 100 % concordantes en las muestras positivas o negativas cualitativas entre todas las réplicas para cada muestra. No se detectó amplificación de ninguno de los objetivos de la nucleocápside (es decir, 0 recuento de gotas para N1 y N2) para ninguno de los virus diferentes a los SARS-CoV-2 ensayados.

Los autores concluyeron que la ddPCR brinda exactitud y sensibilidad para la detección de pacientes con baja carga viral. Las pruebas de SARS-CoV-2 ddPCR también ayudarán a comprender las presentaciones atípicas de COVID-19, incluso en pacientes que presentan síntomas “inexplicables” o secuelas posibles a largo plazo. El estudio fue publicado el 15 de junio de 2022 en la revista Clinica Chimica Acta.

Enlaces relacionados:
Clínica Mayo
Bio-Rad Laboratories
Thermo Fisher Scientific
Qiagen

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