Diseñan análisis con una gota de sangre para monitorizar la resistencia a los medicamentos contra la malaria

Aunque la detección molecular es quizás el método más eficiente, también es el más complejo porque requiere extracción de ADN e instrumentación de PCR.

Para desarrollar un enfoque más adecuado para uso fuera del laboratorio tradicional, los investigadores de la Universidad de Vanderbilt (Nashville, TN, EUA) diseñaron nuevas sondas que, cuando se utilizaron en combinación con una polimerasa Taq tolerante a los inhibidores, permitieron una única genotipificación de un polimorfismo de nucleótido único directamente de la sangre total. La enzima Taq polimerasa es una ADN polimerasa termoestable I que lleva el nombre de la bacteria termofílica Thermus aquaticus, de la que se aisló originalmente. Se usa con frecuencia en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un método para amplificar en gran medida la cantidad de segmentos cortos de ADN.

Las nuevas sondas presentaron dos elementos de diseño estratégico: ácidos nucleicos bloqueados para mejorar la especificidad y los colorantes reporteros Cy5 y TEX615, que tienen menos superposición óptica con los espectros de absorbancia de la sangre que otros colorantes de uso común. El desempeño de la sonda se validó en un instrumento tradicional de laboratorio y luego se probó en un instrumento de PCR adaptable desplegable en el campo.

La PCR adaptativa es una plataforma de PCR en tiempo real, descrita anteriormente, que usaba aditivos de ADN zurdos (L-ADN) para monitorizar la reacción para un desempeño más confiable en el punto de atención. Este método era fundamentalmente más simple y más robusto que la PCR tradicional. Funciona mediante el control dinámico de los ciclos térmicos a través de la supervisión directa de los dos eventos clave de hibridación (anillado del cebador y fusión del producto) durante la reacción.

Los resultados obtenidos durante el estudio revelaron que las sondas podían discriminar entre el P. falciparum de tipo salvaje y un mutante resistente a la cloroquina en presencia de 2% de sangre. Esta estrategia simplificó, en gran medida, la detección del polimorfismo de un solo nucleótido y brindó una alternativa más accesible para la vigilancia de la resistencia a la malaria en el campo.

“Para mitigar la inhibición de los componentes sanguíneos, rediseñamos las herramientas moleculares utilizadas para el análisis de ADN. Utilizamos colorantes reporteros que son más compatibles ópticamente con la sangre, que se combinaron con un tipo específico de subunidad de ADN para identificar con exactitud las mutaciones. El resultado final es un ensayo en el que la sangre se agrega directamente a un tubo de reacción para detectar mutaciones asociadas con la resistencia a los medicamentos contra la malaria”, dijo el autor principal, el Dr. Frederick R. Haselton, profesor de ingeniería biomédica y química en la Universidad de Vanderbilt.

El estudio de resistencia antimalárica se publicó el 13 de junio de 2019 en la edición en línea de la revista Journal of Molecular Diagnostics.

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Universidad de Vanderbilt