Desarrollan dispositivo para prueba molecular para detección de ARN viral

Se desarrolló un sistema de reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa (qRT-PCR) microfluídico, de flujo continuo, para detectar objetivos de ARN viral y su creador ha estado trabajando para reducir los costos de fabricación e identificar socios potenciales para la comercialización.

El sistema qRT-PCR se usa para detectar la ARN polimerasa L (gen L), dirigida por ARN, un biomarcador del virus del Ébola, en una muestra líquida enriquecida. El objetivo actual es desarrollar dispositivos de punto de atención (POC), basados en la tecnología, para diagnosticar enfermedades infecciosas en áreas de bajos recursos.

Los científicos del Centro de Biotecnología Molecular de Fraunhofer USA (Newark, DE, EUA), desarrollaron el chip microfluídico que contiene una bomba de jeringa, calentadores y un sistema de detección óptica. El equipo utilizó la bomba de jeringa para introducir la muestra líquida y los reactivos de PCR en el sistema a través de un conector microfluídico. La solución de ARN purificada entra en una cámara de mezcla y luego se combina con la mezcla maestra, que contiene las enzimas y otros reactivos necesarios para llevar a cabo la amplificación. La mezcla viaja a través de una zona de transcripción inversa, donde las enzimas de transcripción inversa convierten el ARN en ADN complementario.

Los investigadores probaron dos mezclas maestras de transcripción inversa PCR (qRT-PCR) de un paso. El equipo utilizó inicialmente la mezcla maestra comercial Affymetrix VeriQuest ((Thermo Fisher Scientific, Santa Clara, CA, EUA), que está compuesta de transcriptasa inversa y ADN polimerasa. El equipo también desarrolló una mezcla maestra, personalizada, de un solo paso, que combina la mezcla maestra VeriQuest de Affymetrix y la ADN polimerasa rápida incluida en la mezcla maestra de PCR cuantitativa rápida de Affymetrix.

El ADN y los reactivos complementarios recién formados viajan a través de una zona de 95°C, donde la ADN polimerasa se activa y el ADN bicatenario se derrite. La muestra luego viaja al área de ciclado térmico, moviéndose a través de 40 ciclos repetitivos y entre áreas calentadas a 95°C y 62°C. El ADN se derrite en la porción de la zona de temperatura más alta de cada ciclo, mientras que el recocido y la polimerización se produce en la zona de temperatura más baja. El volumen total del canal del chip es de 25 μL, lo que permite un bajo consumo de reactivo y, por lo tanto, reduce los costos de los consumibles.

El sistema de detección óptica se puede usar para medir la fluorescencia y la amplificación de ADN en tiempo real. El equipo demostró que el sistema realiza qRT-PCR en 30 minutos, en comparación con 80 minutos para los termocicladores convencionales de sobremesa. Aunque determinaron que su mezcla maestra personalizada generalmente arrojaba mejores resultados, determinaron el límite de detección del ensayo utilizando la mezcla comercial porque sería aceptada más fácilmente por el mercado. Utilizando la mezcla comercial y el ARN del virus del Ébola como objetivo, el equipo logró un límite de detección de 10 copias de ARN por microlitro.

En el futuro, los autores planean enfocarse en el pretratamiento de la muestra para la extracción de ARN del plasma, la orina y la saliva, ya que la extracción de ARN de alta calidad juega un papel crucial en la producción de resultados exitosos en la qRT-PCR. El objetivo del equipo es comercializar el dispositivo a un precio de dos mil dólares, y los chips desechables de análisis por cincuenta centavos de dólar.