Análisis de un solo paso basado en CRISPR podría agilizar las pruebas de COVID-19

Una prueba de diagnóstico avanzada basada en CRISPR para la COVID-19 produce resultados en 30 a 60 minutos, con una exactitud similar a la prueba RT-qPCR estándar de los CDC (Centros para el Control y la Prevención de Enfermedades) que ahora se usa de rutina.

Se han utilizado métodos como SHERLOCK (desbloqueo del indicador enzimático específico de alta sensibilidad), que normalmente utiliza un proceso de dos pasos (amplificación de la diana seguida de detección de ácido nucleico mediada por CRISPR), para detectar el SARS-CoV-2, el agente causal de la COVID-19. Los requisitos técnicos de este método, sin embargo, son más complejos que los que se utilizan en las pruebas en el punto de atención porque dependen de un paso de extracción de ARN y múltiples pasos de manipulación de líquidos que aumentan el riesgo de contaminación cruzada de las muestras.

Para evitar estas complicaciones, los investigadores del Instituto Tecnológico de Massachusetts (Cambridge, MA, EUA) y sus colaboradores, desarrollaron una prueba simple para la detección del SARS-CoV-2. Se demostró que la sensibilidad de esta prueba es similar a la de los ensayos de reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-qPCR).

La nueva prueba se basó en la plataforma SHERLOCK basada en CRISPR. SHERLOCK utiliza una proteína Cas dirigida al ARN para la detección sensible y específica de ácido nucleico viral. Este método funciona amplificando secuencias genéticas y programando una molécula CRISPR para detectar la presencia de una firma genética específica en una muestra, que también se puede cuantificar. Cuando encuentra esas firmas, la enzima CRISPR se activa y libera una señal robusta. Esta señal se puede adaptar para que se pueda detectar en una simple tira de prueba de papel, en un equipo de laboratorio o para proporcionar una lectura electroquímica que se puede leer con un teléfono móvil.

Para detectar rápidamente el coronavirus, los investigadores modificaron el ensayo basado en CRISPR en “STOP” (prueba SHERLOCK en un recipiente), que era un ensayo optimizado que combinaba la extracción simplificada de ARN viral con amplificación isotérmica y detección mediada por CRISPR. Esta prueba podría realizarse a una sola temperatura en menos de una hora y con un equipo mínimo.

La integración de la amplificación isotérmica con la detección mediada por CRISPR requirió el desarrollo de una solución tampón de reacción común que pudiera adaptarse a ambos pasos. Para amplificar el ARN viral, los investigadores eligieron la transcripción inversa seguida de la amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP) porque los reactivos LAMP están ampliamente disponibles y utilizan soluciones tampón definidas que son adecuadas para las enzimas Cas. LAMP funciona de 55 a 70 grados Celsius y requiere una enzima Cas termoestable como Cas12b de Alicyclobacillus acidiphilus (AapCas12b).

Los investigadores evaluaron sistemáticamente múltiples conjuntos de cebadores LAMP y ARN guía AapCas12b, para identificar la mejor combinación para apuntar al gen N, que codifica la proteína de la nucleocápside del SARS-CoV-2, en una mezcla de reacción de un solo recipiente. Para simplificar la extracción de ARN y aumentar la sensibilidad, los investigadores adaptaron un método de purificación de perlas magnéticas. Las perlas magnéticas concentraron los genomas de ARN del SARS-CoV-2, de un hisopo nasal anterior o nasofaríngeo completo, en una mezcla de reacción STOPCOVID. La prueba se simplificó aún más combinando los pasos de lisis y unión de perlas magnéticas y eliminando los pasos de elución y lavado con etanol para reducir la duración de la extracción de la muestra a 15 minutos con un tiempo mínimo de intervención.

La prueba STOPCOVID se comparó con la prueba estándar de dos pasos de los CDC (es decir, extracción de ARN seguida de RT-qPCR). La concentración de sustrato mediante perlas magnéticas en STOPCOVID permitió la detección de ARN viral de toda la muestra de hisopo, lo que arrojó una entrada (en términos de cantidad de ARN viral) que fue 600 veces mayor que la obtenida con la prueba de los CDC. Como resultado, STOPCOVID detectó de manera confiable una carga viral que era una trigésima parte de la detectada por la prueba CDC RT-qPCR (100 copias por muestra, o 33 copias por mililitro, en comparación con 1000 copias por mililitro).

El desempeño de STOPCOVID se evaluó en una prueba a ciegas realizada en un laboratorio externo. Se obtuvieron de los pacientes un total de 202 muestras de frotis nasofaríngeos positivas para el SARS-CoV-2 y 200 negativas para el SARS-CoV-2. Estas muestras se prepararon agregando 50 microlitros de muestras de hisopados obtenidos de pacientes con COVID-19 a un hisopo limpio, de acuerdo con la recomendación de la Administración de Medicamentos y Alimentos de los EUA con el fin de simular hisopos completos para aplicaciones reglamentarias. Los resultados mostraron que STOPCOVID tenía una sensibilidad del 93,1% y una especificidad del 98,5%. Las muestras positivas se detectaron en 15 a 45 minutos.

“El objetivo es hacer que esta prueba sea fácil de usar y sensible, para que podamos saber si alguien es portador del virus lo antes posible”, dijo el autor principal, el Dr. Feng Zhang, profesor de neurociencias en el Instituto Tecnológico de Massachusetts.

El análisis STOPCOVID se escribió en la edición digital de septiembre 16, 2020 de la revista New England Journal of Medicine.

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Instituto Tecnológico de Massachusetts