Desarrollan secuenciación de próxima generación para la monitorización del quimerismo mixto

El trasplante de células madre hematopoyéticas (TCMH) es el único tratamiento curativo para pacientes con enfermedades hematológicas malignas y no malignas. Cada año se realizan más de 50.000 trasplantes de células madre en todo el mundo y el número va en aumento.

Los pacientes a quienes les realizan un TCMH enfrentan al menos cuatro complicaciones diferentes, como toxicidad relacionada con el tratamiento, infecciones, recurrencia de la enfermedad maligna subyacente y reacciones inmunológicas, incluida la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). El análisis de quimerismo es útil para predecir una recaída amenazante, especialmente cuando se realiza un análisis de quimerismo específico del linaje celular de la leucemia.

Los inmunólogos clínicos del Hospital Universitario Karolinska (Estocolmo, Suecia), incluyeron en un estudio un total de 651 muestras, consistente en 348 muestras artificiales y 303 muestras clínicas para evaluar el desempeño de un ensayo nuevo basado en secuenciación de próxima generación (NGS) (Devyser AB, Estocolmo, Suecia), para monitorear el quimerismo mixto (QM) y comparar su capacidad técnica con las técnicas establecidas para el análisis del quimerismo. Se compararon muestras artificiales y clínicas con cantidades crecientes de ADN del paciente mediante la detección por PCR en tiempo real de indeles y SNP, análisis de fragmentos de repeticiones de tándem corto (STR) y análisis de indeles por NGS.

El equipo utilizó un análisis de marcadores STR interno para el análisis del quimerismo. Se realizaron estudios adicionales utilizando un ensayo de quimerismo comercial basado en STR, procesando muestras por triplicado con el sistema Powerplex 16 (Promega Biotech AB, Nacka, Suecia). El kit Devyser Chimerism NGS se basa en la secuenciación dirigida de 24 indeles y la frecuencia de sus alelos. Cada muestra se amplifica mediante una única reacción de PCR multiplex que contiene 24 pares de cebadores para crear una biblioteca de amplicones diana (PCR1). En una segunda reacción de PCR (PCR2), se introducen adaptadores de secuenciación que incluyen secuencias de índice únicas en cada amplicón, lo que permite agrupar hasta 96 muestras en cada serie de secuenciación.

Los científicos informaron que la PCR en tiempo real mostró una excelente sensibilidad (> 0,01%), pero poca exactitud (> 20% CV en MC> 20%), mientras que el análisis de fragmentos mostró una buena exactitud (<5% CV en MC > 20%) con sensibilidad limitada (> 2,5%). Por el contrario, el quimerismo de NGS demostró una sensibilidad (> 0,1%) igual a la de la PCR en tiempo real y una exactitud igual o mejor que el análisis STR en un amplio rango de quimerismo mixto (0,1 - 100%). Con el fin de evaluar el desempeño de las técnicas separadas para la determinación del quimerismo, se analizaron 75 muestras de monitoreo retrospectivo de pacientes (3 a 7 semanas después del TCMH) con quimerismo bajo (<5%), intermedio (5-20%) o alto mixto (> 20%).

Los autores concluyeron que, en conjunto, el nuevo ensayo de quimerismo basado en NGS puede reemplazar tanto los ensayos basados en STR como los basados en PCR en tiempo real, a través de un mejor desempeño diagnóstico y facilidad de uso. El estudio fue publicado en la edición de enero de 2021 de la revista Clinica Chimica Acta.

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Hospital Universitario Karolinska
Devyser AB
Promega Biotech AB