Secuenciación en células individuales revela diversidad clonal entre los pacientes con LMA

Un cuerpo creciente de evidencia respalda el papel de la diversidad clonal en la resistencia terapéutica, la recurrencia y los malos resultados en el cáncer. La diversidad clonal también refleja la historia de la acumulación de mutaciones somáticas dentro de un tumor.

La capacidad de inferir heterogeneidad clonal y filogenia tumoral a partir de datos de secuenciación masiva es inherentemente limitada, porque las técnicas de secuenciación masiva no pueden inferir de manera confiable ocurrencias simultáneas de mutaciones y, por lo tanto, a menudo fallan en la reconstrucción exacta de la subestructura clonal. La secuenciación de ADN de una sola célula (scADN-seq) puede abordar algunos de estos desafíos.

Un gran equipo de científicos del Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas (Houston, TX, EUA), analizó 154 muestras (140 células mononucleares de médula ósea (BMMC) y 14 células mononucleares de sangre periférica) de 123 pacientes con leucemia mieloide aguda (LMA) que tenían al menos una mutación somática cubierta por el panel dirigido para scADN-seq. De los 123 pacientes, 108 pacientes fueron analizados antes del tratamiento (N = 98) o en el punto de tiempo de recaída/refractaria (N = 10). Entre 123 pacientes, 97 fueron analizados por scADN-seq, 23 fueron analizados por secuenciación simultánea de ADN de una sola célula y de las proteínas de superficie celular (scADN+protein-seq), y tres fueron analizados por scADN-seq y scADN+protein-seq.

La biblioteca agrupada se secuenció mediante una de las siguientes plataformas de secuenciación, MiSeq, HiSeq 4000 o NovaSeq 6000 (Illumina, San Diego, CA, EUA), con el procesamiento de pares de bases (pb) de 150 o 250 pares multiplexadas en el extremo. El equipo realizó una PCR digital por gotitas (ddPCR) utilizando el sistema digital QX200 Droplet (Bio-Rad Laboratories, Hércules, CA, EUA), para confirmar las variantes que fueron detectadas por scADN-seq, pero que no fueron detectadas por la secuenciación masiva. Se realizó un perfil simultáneo de la mutación del ADN y el inmunofenotipo de la superficie celular (scADN+protein-seq) utilizando el kit de panel de diseño personalizado y 10-15 anticuerpos oligoconjugados (Mission Bio, South San Francisco, CA, EUA). Los inmunofenotipos de las células de la médula ósea de pacientes con LMA se evaluaron mediante citometría de flujo de ocho colores en un instrumento FACSCanto II (BD Biosciences, San José, CA, EUA).

En total, los científicos secuenciaron más de 730.000 células para encontrar 543 mutaciones somáticas en 31 genes relacionados con el cáncer, el 98% de los cuales fueron validados ortogonalmente. Las mutaciones más comunes que detectaron fueron en NPM1, seguidas de las de DNMT3A y NRAS. Además, consiguieron que si bien se encontraron varias mutaciones que eran funcionalmente redundantes en los mismos pacientes, las alteraciones se encontraron a menudo en clones mutuamente excluyentes. Esto se extendió a las alteraciones que afectan a los genes de la vía de señalización del receptor tirosina quinasa (RTK)/Gas GTPasa (RAS)/MAP quinasa (MAPK), así como a las mutaciones IDH1 e IDH2 y a las mutaciones TET2 e IDH. Esto sugirió a los científicos que las células no necesitan dos mutaciones o que, cuando aparecen juntas, las mutaciones son tóxicas, lo que podría sugerir una posible vía de tratamiento para investigar.

Los investigadores también analizaron las correlaciones genotipo-fenotipo entre las células para encontrar, por ejemplo, que las células con mutaciones en NPM1 o IDH expresaban niveles más bajos de CD34 y HLA-DR, mientras que las células con una sola mutación en TP53 tenían un fenotipo CD34+ CD117+, pero que las mutaciones dobles en TP53 tenían un inmunofenotipo monocítico.

Koichi Takahashi, MD, PhD, autor principal del estudio, dijo: “Esta información también está disponible, de alguna manera, a partir de datos de secuenciación masiva longitudinal, pero creo que los datos de una sola célula proporcionan de manera única esta visión meticulosa de la dinámica clon por clon, lo que simplemente no es posible mediante la secuenciación masiva”. El estudio fue publicado el 21 de octubre de 2020 en la revista Nature Communications.

Enlace relacionado:
Centro de Cáncer MD Anderson de la Universidad de Texas
Bio-Rad Laboratories
Mission Bio
BD Biosciences