Dispositivo de sobremesa de bajo costo detecta las variantes del SARS-CoV-2 en una muestra de saliva en una hora

Los investigadores han creado una prueba de diagnóstico económica basada en CRISPR que permite a los usuarios hacerse la prueba de SARS-CoV-2 y múltiples variantes del virus utilizando una muestra de su saliva en casa, sin necesidad de instrumentación adicional.

El dispositivo de diagnóstico, llamado SHERLOCK Mínimamente Instrumentado (miSHERLOCK), fue desarrollado por investigadores del Instituto Wyss de Ingeniería Inspirada en la Biología de la Universidad de Harvard (Boston, MA, EUA) y el Instituto Tecnológico de Massachusetts (MIT; Cambridge, MA, EUA). Es fácil de usar y proporciona resultados que se pueden leer y verificar mediante una aplicación de teléfono inteligente adjunta, en una hora. Distinguió con éxito entre tres variantes diferentes de SARS-CoV-2 en experimentos y se puede reconfigurar rápidamente para detectar variantes adicionales como Delta. El dispositivo se puede ensamblar utilizando una impresora 3D y componentes comúnmente disponibles por alrededor de 15 dólares, y la reutilización del hardware reduce el costo de los ensayos individuales a 6 dólares cada uno.

Para la parte de detección de SARS-CoV-2 de su diagnóstico, los investigadores recurrieron a una tecnología basada en CRISPR, creada en el laboratorio del miembro del Profesorado Principal de Wyss, y que el autor principal del artículo Jim Collins, Ph.D. había denominado “desbloqueo específico de reportero enzimático de alta sensibilidad” (SHERLOCK). SHERLOCK utiliza las “tijeras moleculares” de CRISPR para cortar ADN o ARN en ubicaciones específicas, con una ventaja adicional: al reconocer su secuencia objetivo, este tipo específico de tijeras también corta otras piezas de ADN en el área circundante, lo que permite su ingeniería. para producir una señal que indique que el objetivo se ha cortado con éxito.

Los investigadores crearon una reacción SHERLOCK diseñada para cortar el ARN del SARS-CoV-2 en una región específica de un gen llamado nucleoproteína que se conserva en múltiples variantes del virus. Cuando las tijeras moleculares, una enzima llamada Cas12a, se une con éxito al gen de la nucleoproteína y lo corta, también se cortan las sondas de ADN monocatenario, lo que produce una señal fluorescente. También crearon ensayos SHERLOCK adicionales diseñados para apuntar a un panel de mutaciones virales en secuencias de proteínas Spike que representan tres variantes genéticas del SARS-CoV-2: Alfa, Beta y Gamma.

Armado con ensayos que podrían detectar de manera confiable ARN viral dentro del rango de concentración aceptado para las pruebas de diagnóstico autorizadas por la FDA, el equipo centró sus esfuerzos en resolver lo que podría decirse que es el desafío más difícil en el diagnóstico: la preparación de muestras. El equipo eligió usar saliva en lugar de muestras de hisopos nasofaríngeos como material de fuente de diagnóstico, porque es más fácil para los usuarios recolectar saliva y los estudios han demostrado que el SARS-CoV-2 es detectable en la saliva durante un mayor número de días después de la infección. Pero la saliva sin procesar presenta sus propios desafíos: contiene enzimas que degradan varias moléculas, produciendo una tasa alta de falsos positivos.

Los investigadores desarrollaron una técnica novedosa para resolver ese problema. Primero, agregaron dos reactivos químicos llamados DTT y EGTA a la saliva y calentaron la muestra a 95°C durante tres minutos, desactivaron las enzimas que producían la señal falsa positiva de la saliva sin tratar y cortaron las partículas virales. A continuación, incorporaron una membrana porosa que fue diseñada para atrapar ARN en su superficie, que finalmente podría agregarse directamente a la reacción de SHERLOCK para generar un resultado.

Para integrar la preparación de la muestra de saliva y la reacción de SHERLOCK en un diagnóstico, el equipo diseñó un dispositivo simple que funciona con baterías con dos cámaras: una cámara de preparación de muestras calentada y una cámara de reacción sin calefacción. Un usuario escupe en la cámara de preparación de muestras, enciende la calefacción y espera de tres a seis minutos a que la saliva penetre en el filtro. El usuario quita el filtro y lo transfiere a la columna de la cámara de reacción, luego empuja un émbolo que deposita el filtro en la cámara y perfora un depósito de agua para activar la reacción SHERLOCK. Después de 55 minutos, el usuario mira a través de la ventana del transiluminador atenuado hacia la cámara de reacción y confirma la presencia de una señal fluorescente. También pueden utilizar una aplicación de teléfono inteligente que analiza los píxeles registrados por la cámara del teléfono inteligente para proporcionar un diagnóstico claro positivo o negativo.

Los investigadores probaron su dispositivo de diagnóstico utilizando muestras clínicas de saliva de 27 pacientes con COVID-19 y 21 pacientes sanos y encontraron que miSHERLOCK identificó correctamente a los pacientes COVID-19 positivos el 96% de las veces y a los pacientes sin la enfermedad el 95% de las veces. También probaron su desempeño contra las variantes Alfa, Beta y Gamma del SARS-CoV-2 al agregar saliva humana sana con ARN viral sintético de longitud completa que contiene mutaciones que representan cada variante y encontraron que el dispositivo era efectivo en una variedad de concentraciones de ARN viral.

“Una de las mejores cosas de miSHERLOCK es que es completamente modular. El dispositivo en sí está separado de los ensayos, por lo que puede conectar análisis diferentes para la secuencia específica de ADN o ARN que trata de detectar”, dijo la primera coautora, Devora Najjar una asistente de investigación en el Laboratorio de Medios de MIT y en el Laboratorio Collins. “El dispositivo cuesta alrededor de 15 dólares, pero la producción en masa reduciría los costos de la carcasa a alrededor de 3 dólares. Los ensayos para nuevos objetivos se pueden crear en aproximadamente dos semanas, lo que permite el rápido desarrollo de pruebas para nuevas variantes de SARS-CoV-2, así como para otras enfermedades infecciosas”.

“miSHERLOCK elimina la necesidad de transportar las muestras de los pacientes a una ubicación de prueba centralizada y simplifica enormemente los pasos de preparación de muestras, brindando a los pacientes y médicos una imagen más rápida y exacta de la salud individual y comunitaria, que es fundamental durante una pandemia en evolución”, dijo la primera coautora Helena de Puig, Ph.D., becaria postdoctoral del Instituto Wyss y del MIT.

Enlace relacionado:
Instituto Wyss de Ingeniería Inspirada en la Biología de la Universidad de Harvard
Instituto Tecnológico de Massachusetts